Elettroporazione ex vivo di fette cerebellari di embrioni di pollo: un metodo per introdurre il DNA plasmidico che codifica la proteina fluorescente verde per visualizzare lo sviluppo delle cellule granulari

In questo articolo

Abstract

Fonte: Hanzel, M. et al.Coltura ex vivo di fette cerebellari di pollo ed elettroporazione spazialmente mirata di precursori di cellule granulari.J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, eseguiamo l'elettroporazione di fette di cervelletto di embrioni di pollo con plasmidi genetici reporter. La tecnica facilita la visualizzazione dello sviluppo e della migrazione dei precursori delle cellule granulari per formare uno strato granulare.

Protocollo

1. Elettroporazione delle fette

Costruire una camera di elettroporazione fissando l'anodo di un elettroporatore alla base di una piastra di Petri da 60 mm con nastro isolante. Aggiungere circa 1 mL di HBSS per coprire l'elettrodo.
Posizionare un inserto di coltura da 0,4 μm sopra l'elettrodo ricoperto di HBSS. Lasciare che l'inserto di coltura poggi sull'elettrodo, assicurandosi che ci sia sempre contatto tra l'inserto e l'elettrodo.
nota: In questa configurazione, l'inserto di coltura con le fette poggerà sulla superficie della soluzione, mantenendo il circuito ma consentendo il targeting spaziale del catodo.
Trasferire le fette identificate (fino a cinque per ogni foglietto illustrativo) sull'inserto di coltura utilizzando una pipetta Pasteur da 3 ml con il puntale tagliato. Separare e lasciare che si stabilisca sull'inserto di coltura con orientamento sagittale.
Utilizzando una pipetta, rimuovere l'eccesso di HBSS in modo che le fette non siano più immerse nella soluzione.
Utilizzando un puntale per pipetta P10, pipettare il DNA (a una concentrazione di 1 μg/μL) diluito con il 20% di verde rapido sulla superficie della regione mirata di una fetta. Il 20% di verde rapido garantisce una soluzione viscosa di DNA e impedisce una dispersione proibitiva del DNA. Aggiungere circa 5 μL di DNA/soluzione fast green a ciascuna fetta (Figura 1B).
Posizionare il catodo sul tessuto mirato desiderato ed elettroporare con impulsi di durata 3 x 10 V, 10 msec. Evitare il contatto diretto del catodo con il tessuto. Invece, sfrutta la tensione superficiale del liquido per mantenere la conduttanza (posiziona il catodo il più vicino possibile al tessuto senza toccare effettivamente il tessuto).
Ripetere la consegna del DNA e l'elettroporazione in più regioni di EGL su ogni singola fetta cerebellare come desiderato.
Al termine dell'elettroporazione, trasferire l'inserto di coltura in una piastra di Petri da 30 mm.
A ciascuna coltura, aggiungere 1 ml di terreno di coltura preriscaldato (Basal Medium Eagle, 0,5% (p/v) D-(+)-glucosio, 1% di integratore di B27, 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina) sotto l'inserto di coltura in modo che l'inserto di coltura sia a contatto con il terreno, ma le fette non vi siano bagnate.
Incubare le colture a 37 °C/6% di CO₂ per un massimo di 3 giorni. Sostituire tutto il terreno di coltura ogni 24 ore con un terreno fresco e preriscaldato.
Dopo la coltura, fissare le fette sugli inserti di coltura per 1 ora in paraformaldeide al 4% (o O/N a 4 °C) in una piastra fresca da 30 mm senza terreni di coltura.

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Risultati

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Figura 1. La camera di elettroporazione allestita. (A) Un'immagine della camera di elettroporazione su misura. La camera è costituita da un anodo di un elettroporatore posizionato in modo sicuro sulla base di una piastra di Petri da 60 mm. La piastra contiene circa 1 mL di HBSS per coprire l'elettrodo. L'inserto di coltura deve poggiare sull'elettrodo con un contatto...