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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione del cervelletto e preparazione delle sezioni (tempo pratico ≈ 15-20 minuti per animale)
- Posizionare una delle piastre per colture cellulari da 60 mm contenenti il mezzo di dissezione ghiacciato sotto il microscopio binoculare e rimuovere la piastra superiore.
- Tamponare il pelo della testa con etanolo al 70% (evitando accuratamente di toccare gli occhi dell'animale) e decapitare l'animale utilizzando grandi forbici affilate, secondo la procedura approvata.
NOTA: Le fette cerebellari sono generate da topi P9-P10 senza alcun pregiudizio specifico di sesso o ceppo.
- Usa piccole forbici per tagliare la pelle lungo la linea mediana della testa partendo dal collo e risalendo fino al muso del topo.
- Per tenere la testa ed esporre il cranio, piegare indietro la pelle ventralmente sotto la testa e pizzicare le due pieghe della pelle tra le dita.
- Inserire delicatamente le forbicine nel forame magno e tagliare il cranio praticando un'incisione laterale verso il lato e poi tagliare tutto intorno al cranio della testa. Tieni la punta delle forbici il più parallela e vicino possibile al cranio durante il taglio, per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.
- Recupera la parte dorsale del cranio usando una pinza fine-dritta. Mentre sollevi con cura la parte dorsale del cranio, taglia le meningi aderenti (membrana irrigata traslucida che circonda il tessuto cerebrale) se necessario con piccole forbici per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.
- Introdurre con cautela una pinza dritta (o in alternativa usare una spatola) tra il cranio ventrale e il cervello, sollevare delicatamente il cervello e tagliare i nervi ottico e trigemino con piccole forbici.
- Aiuta il cervello a cadere per gravità nel piatto di coltura cellulare da 60 mm contenente terreno di dissezione ghiacciato capovolgendo la testa appena sopra il piatto e rilasciando le ultime aderenze con piccole forbici, se necessario.
- Usando una pinza fine, orienta il cervello con il lato dorsale rivolto verso il ricercatore e il lato ventrale sdraiato sul fondo del piatto.
- Sotto il microscopio binoculare, usa la pinza fine-dritta per immobilizzare il cervello sul lato del proencefalo ed evita di toccare il rombencefalo, poiché potrebbe danneggiarsi. Separare il rombencefalo dal resto del cervello (prosencefalo e mesencefalo, vedere lo schema nella Figura 1Aa), utilizzando una pinza dritta fine. Per separare il cervelletto dal resto del rombencefalo, utilizzare la pinza fine per tagliare i peduncoli cerebellari sotto il cervelletto (vedi schema nella Figura 1Aa').
- Una volta isolato il cervelletto, strappare con cura le meningi utilizzando una pinza fine e diritta (vedi schema nella Figura 1Aa').
- Tenere delicatamente il cervelletto con la pinza curva sottile e posizionarlo con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla piattaforma di plastica perpendicolarmente alla lama del rasoio chopper (vedere lo schema nella Figura 1Bb).
- Aspirare l'eventuale eccesso di terreno di dissezione intorno al cervelletto utilizzando un puntale sterile per pipetta con estremità sottile adattato su una pipetta da 1 ml (vedere lo schema nella Figura 1Bb).
- Assicurarsi che il cervelletto sia piatto, ma non allungato, una volta posizionato sulla piattaforma per ottenere fette sagittali ottimali durante il sezionamento (vedere lo schema sulla Figura 1Bb).
- Affettare sezioni sagittali del cervelletto spesse 300 μm con il tritatutto (vedere lo schema alla Figura 1Bb'). La forza e la velocità della pala devono essere ottimizzate in loco.
- Aggiungere delicatamente una goccia di terreno di dissezione sul cervelletto affettato. Utilizzando una punta di pipetta a foro largo posizionata su una pipetta da 1 mL, aspirare lentamente il cervelletto affettato e trasferirlo nuovamente nella piastra di coltura cellulare da 60 mm contenente terreno di dissezione ghiacciato (vedere lo schema nella Figura 1Bb'').
- Pulisci la piattaforma di plastica del tritatutto con etanolo al 100% tra ogni taglio del cervelletto. Lascia evaporare l'etanolo prima di posizionare il cervelletto successivo sulla piattaforma.
- Utilizzare due pinze dritte (o in alternativa aghi in titanio) per separare le singole fette e selezionare 6-8 fette dal verme (vedere lo schema sulla Figura 1Cc e 1Cc').
- Prelevare una piastra a 6 pozzetti con inserti di coltura e trasferire fino a 4 fette selezionate su un inserto di coltura insieme a un po' di terreno di dissezione, utilizzando un puntale per pipetta a foro largo adattato su una pipetta da 1 mL (vedere lo schema nella Figura 1Cc').
- Posizionare le fette al centro dell'inserto di coltura utilizzando il mezzo di dissezione o la pinza per spingerle e tirarle delicatamente nella giusta posizione, evitando che siano in contatto tra loro (vedi schema in Figura 1Cc').
- Rimuovere l'eccesso di terreno di dissezione intorno alle fette utilizzando un puntale per pipetta con estremità sottile. Assicurarsi che le fette siano piatte sulla membrana (vedi schema in Figura 1Cc').
- Posizionare la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore subito dopo aver aggiunto le fette sulla membrana.
