Elettroporazione di singole cellule in colture organotipiche di fette di cervello: una tecnica in vitro per fornire plasmidi all'interno di neuroni mirati in fette di ippocampo cerebrale

Abstract

Fonte: Keener, D. G. et al. Elettroporazione a singola cellula attraverso diverse colture di fette organotipiche di neuroni eccitatori e inibitori specifici dell'ippocampo di topo. (2020)

Questo video dimostra il protocollo per l'elettroporazione di geni a singola cellula sia nei neuroni eccitatori che in quelli inibitori in una serie di colture di fette di ippocampo in vitro. La tecnica è utile per esaminare specifiche funzioni molecolari e fisiologiche dei neuroni, compresi i meccanismi autonomi delle cellule e le interazioni proteiche transsinaptiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della Cultura a Fette

1. Preparare colture di fette ippocampali organotipiche di topo utilizzando topi postnatali di 6-7 giorni di entrambi i sessi.
   1. Preparare i terreni di dissezione per la coltura organotipica di fette costituite da (in mM): 238 saccarosio, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ e 11 glucosio in acqua deionizzata, qu....

Risultati

Figura 1: Due immagini rappresentative della pipetta di vetro. (A) Visualizzare pipette a resistenza inferiore (6,5 MΩ), utilizzate in questo protocollo, e (B) pipette a resistenza superiore (10,4 MΩ) tipiche dei protocolli di elettroporazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione del plasmide
Kit di purificazione dei plasmidi	Qiagen	Codice 12362
Preparazione organotipica della coltura di fette
Piastre a 6 pozzetti	GREINER BIO-ONE	Codice 657160
Pinze Dumont #5/45	FST	#5/45	Pinze di dissezione angolate per la preparazione di colture di fette organotipiche
Unità filtro pallone	Millipore	SCHVU02RE	Filtrazione e conservazione dei terreni di coltura
incubatrice	raccoglitore	BD C150-UL
Trinciafazzoletti McIlwain	TED PELLA, INC.	Codice: 10180	Tritatutto per la preparazione di colture organotipiche di fette
Inserto per colture cellulari Millicell, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Inserti organotipici per colture di fette
Osmometro	Sistemi di precisione	OSMETTE II
Spatole rivestite in PTFE	Cole-Parmer	SK-06369-11
forbici	FST	Codice: 14958-09
Stereomicroscopio	Olimpo	SZ61
Sistema di filtrazione sottovuoto sterile	Millipore	SCGPT01RE	Filtrazione e stoccaggio di aCSF
Preparazione degli elettrodi
Occhiali capillari	Strumenti Warner	640796
Estrattore per micropipetter	Strumento Sutter	P-1000	Estrattore
forno	raccoglitore	BD (E2)
Filamento estrattore	Strumento Sutter	FB330B	Estrattore
Piastre Petri Falcon da 3,5 mm	Falco BD	353001
Tavolo d'aria	Catalogo TMC	63-7512E
Telecamera CCD	Q Imaging	Retiga-2000DC	macchina fotografica
Sistema di elettroporazione	Dispositivi molecolari	Assoporatore 800A	Elettroporatore
Sistema di illuminazione a fluorescenza	priore	Lumen 200
manipolatore	Strumento Sutter	Pannello MPC-385	manipolatore
Software Metamorph	Dispositivi molecolari		Acquisizione delle immagini
Pompa peristaltica	Rainin	Dynamax, RP-2	Pompa di perfusione
Tavolo mobile	Luigs & Neuman	240 XY
altoparlante	sconosciuto		Altoparlanti collegati all'elettroporatore
Stereomicroscopio	Olimpo	SZ30
Incubatrice da tavolo	Termo Scientifico	MIDI 40
Microscopio verticale	Olimpo	BX61WI