Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della Cultura a Fette
- Preparare colture di fette ippocampali organotipiche di topo utilizzando topi postnatali di 6-7 giorni di entrambi i sessi.
- Preparare i terreni di dissezione per la coltura organotipica di fette costituite da (in mM): 238 saccarosio, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glucosio in acqua deionizzata, quindi gas con 5% di CO2/95% O2 a un pH di 7,4.
- Preparare terreni di coltura organotipici a fette costituiti da: 78,8% (v/v) di Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) di siero di cavallo, 17,9 mM di NaHCO3, 26,6 mM di glucosio, 2 M di CaCl2, 2 M di MgSO4, 30 mM di HEPES, insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM di acido ascorbico, pH regolato a 7,3. Regolare l'osmolarità a 310–330 osmolo utilizzando un osmometro.
- Sezionare l'ippocampo dall'intero cervello usando due spatole e affettare (400 μm) usando un tritatessuti. Separare le fette utilizzando due pinze e trasferirle su inserti di coltura cellulare da 30 mm in una piastra a 6 pozzetti riempita con terreno di coltura (950 μL) sotto gli inserti.
- Conservare le colture di fette organotipiche in un incubatore di coltura tissutale (35 °C, 5% di CO2) e cambiare il terreno di coltura a fette ogni due giorni.
2. Preparazione del plasmide
- Preparare il plasmide per il gene di interesse.
- Gene della proteina fluorescente verde potenziato con subclone (EGFP) in un vettore pCAG.
- Purificare il plasmide pCAG-EGFP con un kit di purificazione privo di endotossine e scioglierlo in una soluzione interna costituita da acqua trattata con dietil pirocarbonato contenente 140 mM di K-metansolfonato, 0,2 mM di EGTA, 2 mM di MgCl2 e 10 mM di HEPES, regolato a pH 7,3 con KOH (concentrazione plasmidica: 0,1 μg/μL).
3. Preparazione della pipetta di vetro
- Tirare le pipette in vetro borosilicato (4,5–8 MΩ) su un estrattore per micropipette (Figura 1A).
nota: Le pipette in vetro utilizzate per le registrazioni con patch clamp a cellula intera sono ideali per l'elettroporazione.
- Cuocere le pipette di vetro per una notte a 200°C per sterilizzarle.
- Controllare le dimensioni della punta della pipetta al microscopio da dissezione per approssimare la resistenza elettrica.
- Opzionale: verificare la resistenza della pipetta collegando la pipetta all'elettrodo di elettroporazione e utilizzare il micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sterilizzato con filtro contenente (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glucosio in acqua deionizzata, gassata con 5% CO2/95% O2fino a un pH di 7,4. Confermare la resistenza effettiva utilizzando la lettura sull'elettroporator.
nota: Più affilata è la punta della pipetta, maggiore è la resistenza elettrica. La resistenza della pipetta deve essere inferiore a 10 MΩ. Le pipette in vetro con elevata resistenza alla pipetta (Figura 1B) spesso si intasano sul puntale durante l'elettroporazione ripetuta.
4. Configurazione dell'impianto di elettroporazione
- Installare l'elettroporatore su un impianto standard di elettrofisiologia a cellule intere, dotato di un microscopio verticale montato su una tavola mobile con un micromanipolatore e una pompa peristaltica.
- Installare l'headstage dell'elettroporatore su un micromanipolatore e collegare una coppia di altoparlanti all'elettroporatore. Collegare l'elettroporatore a un pedale che può essere utilizzato per inviare un impulso quando è pronto.
nota: Gli altoparlanti emettono un segnale acustico quando sono accesi, che è un indicatore della resistenza elettrica all'elettrodo. Ciò consente di determinare le variazioni relative della resistenza senza distogliere l'attenzione dalla procedura.
5. Preparazione all'elettroporazione
- Trasferire gli inserti di coltura a fette da piastre a 6 pozzetti a piastre di Petri da 3 cm caricate con 900 μL di terreno di coltura e conservarli in un incubatore di CO2 da tavolo fino al momento di eseguire l'elettroporazione.
- Preincubare gli inserti di coltura freschi con terreni di coltura a fette (1 mL) per almeno 30 minuti in una piastra di Petri da 3,5 cm per coltivare le fette dopo l'elettroporazione.
- Pulire e preparare il rig per l'elettroporazione.
- Perfondere le linee con candeggina al 10% per 5 minuti per sterilizzare il tubo e la camera prima di iniziare l'esperimento per la giornata.
- Perfondere le linee con acqua autoclavata deionizzata per almeno 30 minuti per risciacquare completamente.
- Perfondere le linee con aCSF sterilizzato con filtro contenente 0,001 mM di tetrodotossina (TTX).
nota: La TTX riduce al minimo la tossicità cellulare e la morte dovuta alla sovraeccitazione degli interneuroni.
- Impostare i parametri dell'impulso dell'elettroportatore: ampiezza di –5 V, impulso quadrato, treno di 500 ms, frequenza di 50 Hz e un'ampiezza dell'impulso di 500 μs.
- Riempire la pipetta di vetro con 5 μL di soluzione interna contenente plasmidi.
- Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate dal puntale della pipetta muovendo e picchiettando delicatamente il puntale più volte.
- Controllare che la punta non sia danneggiata visualizzandola al microscopio da dissezione o ripetendo il passaggio 3.3.1 per verificare la resistenza della pipetta.
nota: Se il puntale è danneggiato, la pipetta di vetro deve essere scartata e questo passaggio deve essere ripetuto con una nuova pipetta di vetro precedentemente preparata nel passaggio 3.
- Fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo e accendere gli altoparlanti. Registrare la lettura (la resistenza della pipetta) dell'elettroporatore quando il puntale è entrato in contatto con il mezzo aCSF.
- Tagliare la membrana dell'inserto di coltura utilizzando una lama affilata e isolare una fetta di coltura. Trasferire con cura la coltura a fette nella camera di elettroporazione utilizzando una pinza ad angolo acuto e fissarne la posizione con un'ancora a fette.
- Non tenere la coltura di fette fuori dall'incubatrice per più di 30 minuti alla volta per prevenire effetti collaterali come cambiamenti nella salute o nella funzione neuronale.
6. Celle Elettroporate di Interesse
- Applicare una pressione positiva sulla pipetta con la bocca o utilizzando una siringa da 1 ml (pressione 0,2-0,5 ml) collegata al tubo.
- Utilizzare i comandi tridimensionali della manopola del micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura a fette.
- Scegli una cellula bersaglio e avvicinati, mantenendo la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare, visibile al microscopio.
- Eseguire cicli di pressione.
- Applicare rapidamente una leggera pressione negativa con la bocca in modo che si formi una tenuta allentata tra il puntale della pipetta e la membrana plasmatica, indicata visivamente dalla membrana che sale leggermente nel puntale della pipetta. Osservare un aumento (~2,5 volte la resistenza iniziale) della resistenza della pipetta ascoltando un aumento del tono proveniente dagli altoparlanti. Riapplicare rapidamente la pressione positiva in modo che la fossetta si riformi.
- Completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione senza pause, quindi mantenere la pressione negativa per 1 s.
nota: Mettere in pausa tra un ciclo e l'altro, applicare troppa pressione o mantenere la pressione negativa troppo a lungo può causare danni significativi alla cella e possibilmente causare la morte della cella durante l'elettroporazione.
- Pulsare rapidamente l'elettroporatore una volta utilizzando il pedale quando il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile dell'intonazione, indicando il picco di resistenza elettrica. Non attendere il picco di resistenza per più di 1 s prima di inviare l'impulso.
nota: Non abbiamo osservato alcuna elettroporazione fuori bersaglio quando si utilizza questo protocollo. Sono state trasfettate solo le cellule a contatto con la pipetta di vetro durante i cicli di pressione. Il posizionamento della pipetta vicino ad altri neuroni non provoca la trasfezione genica.
- Ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 μm dalla cella senza applicare pressione.
- Riapplicare la pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura registrata nel passaggio 5.5, quindi avvicinarsi alla cella successiva.
- Rimuovere potenziali ostruzioni, indicate visivamente o da una resistenza della pipetta significativamente aumentata (>15% in più) dopo l'elettroporazione, applicando una pressione positiva.
nota: Se non ci sono ostruzioni visibili e la resistenza è ancora significativamente più alta, gettare la pipetta e utilizzarne una nuova. In media, una pipetta può essere utilizzata per un massimo di 20 eventi di elettroporazione se l'utente presta attenzione.
Dopo l'elettroporazione, trasferire la coltura a fette su un inserto di coltura fresco e incubare a 35°C nell'incubatore per un massimo di 3 giorni.
