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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prelievo del midollo spinale
NOTA: Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati in autoclave (135 °C e 30 psi per cicli di 4 x 7 minuti).
- Eutanasia di cuccioli di topo C57BL/6 di 1-3 giorni in una camera con isoflurano. Attendere 30 s dopo la cessazione del movimento e pizzicare la gamba per confermare la mancanza di risposta.
- Separare la testa dal corpo usando le forbici, con il cucciolo in posizione prona.
- Stabilizzare le zampe posteriori o la coda e le braccia sul tavolo operatorio, con il lato dorsale rivolto verso l'utente.
- Taglia la pelle usando le forbici per l'iride curva.
- Taglia il midollo spinale dalla regione lombare appena sopra i fianchi e procedi a tagliare entrambi i lati del torace per separarlo dal corpo><.
nota: Ciò richiede un'attenta dissezione del midollo spinale dagli organi viscerali per evitare danni involontari ad altri organi (Figura 1a).
- Lavare in sequenza per 10 s in piastre di Petri da 3 x 10 cm contenenti 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sterilizzata con filtro da 0,2 μm per rimuovere il tessuto in eccesso.
- Inserire un ago da 22 G e una siringa riempita con 5 mL di PBS sterilizzato con filtro nell'estremità caudale della colonna vertebrale e sciacquare cranialmente, consentendo al cordone di uscire in una quarta capsula di Petri (Figura 1b).
- Raccogliere il midollo spinale in una provetta da 15 ml con 5 ml di HABG (Tabella 1) su ghiaccio. Prestare attenzione per evitare di schiacciare il midollo spinale.
- Ripetere i passaggi 1.1-1.8 per ogni cucciolo della cucciolata.
nota: Idealmente, questo processo dovrebbe richiedere meno di 30 minuti per midollo spinale per garantire un sano isolamento dei neuroni.
2. Isolare i Neuroni
NOTA: Il seguente passaggio dovrebbe essere eseguito in una cappa a flusso laminare. Ci si aspetta familiarità con la tecnica sterile di base.
- Tritatura dei tessuti
- Prendi il tubo contenente il midollo spinale e agita leggermente per sospendere il tessuto.
- Versare il fazzoletto dal tubo in una capsula di Petri di vetro da 60 mm e tagliare a dadini con una lama di rasoio per creare pezzi fini di ~0,5 mm.
- Trasferire il fazzoletto con una pipetta a foro largo in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di HABG.
- Metterlo a bagnomaria a 30 °C per 30 minuti per permettere alle cellule di equilibrarsi a questa temperatura. Tenere le cellule su un agitatore quanto basta per permetterne la sospensione nel fluido.
nota: Questo passaggio viene eseguito per evitare di scioccare le cellule al momento del trasferimento dal ghiaccio al mezzo di digestione. Mantenere le cellule a 30 °C aiuta a ridurre la morte cellulare associata a un metabolismo altrimenti aumentato a 37 °C.
- Preparare il mezzo di digestione (Tabella 1).
- Preparare il gradiente di densità (Tabella 1).
- Preparare ciascuno dei 4 strati in 4 provette separate da 15 ml, come indicato nella Tabella 1.
- Aggiungere 1 mL da ogni strato in una nuova provetta da 15 mL. Inizia con lo strato 1 in basso e aggiungi in sequenza fino a raggiungere lo strato 4 in alto. Evita di disturbare gli strati durante l'aggiunta.
- Lavare le piastre rivestite in PDL. Lavare con acqua sterile per alcuni minuti prima di rimuovere l'acqua residua e lasciarli asciugare per 1 ora.
- Trasferire il tessuto nel mezzo di digestione.
- Togliere il tubo contenente il fazzoletto dal bagnomaria dello shaker a 30 °C e lasciarlo riposare per alcuni minuti.
- Estrarre il tubo del mezzo di digestione dal bagnomaria a 37 °C e aspirarlo in una siringa leur-lock.
- Aspirare l'eccesso di HABG dal tubo contenente il tessuto.
- Utilizzare un filtro leur-lock da 0,2 μm sulla siringa per aggiungere il mezzo di digestione al tubo contenente il tessuto.
- Immergere la provetta in un bagno d'acqua a 30 °C per 30 minuti. Mantenere le cellule agitate quel tanto che basta per permetterne la sospensione nel fluido.
nota: È importante non tenere le cellule nel mezzo di digestione troppo a lungo o lasciare che la temperatura diventi troppo alta, il che potrebbe portare a una digestione eccessiva e provocare la sospensione del tessuto in una miscela gelatinosa.
- Durante questo periodo, rivestire la laminina.
- Eseguire la triturazione (cioè separare le cellule dal tessuto).
- Togliere il tubo dal bagnomaria a 30 °C e lasciarlo riposare per qualche minuto.
- Aspirare il mezzo di digestione in eccesso.
- Sospendi il tessuto in 2 ml di HABG.
- Utilizzando una pipetta a foro stretto, triturare 10x per 45 s.
nota: Questo è probabilmente il passaggio più cruciale e può ridurre significativamente la resa se non eseguito correttamente.
- Aspirare il fazzoletto nella pipetta e svuotare immediatamente il contenuto.
- Evitare l'introduzione di aria, in quanto ridurrà significativamente la resa vitale.
nota: La pipetta ideale è una pipetta in vetro da 9". La punta della pipetta deve essere lucidata a fuoco per levigare le superfici ruvide. Deve quindi essere siliconato mediante posizionamento in una soluzione 1:20 di diclorodimetilsilano (DMDCS) in cloroformio e lasciato O/N. La pipetta deve quindi essere rimossa e lasciata asciugare all'aria. Successivamente, dovrebbe essere sterilizzato in autoclave.
cautela: Il DMDCS e il cloroformio sono altamente infiammabili e la siliconatura deve essere eseguita in una cappa aspirante.
- Aspirare i 2 mL superiori di surnatante e metterli in una nuova provetta da 15 mL etichettata come "collezione".
- Ripetere i passaggi da 2.7.3 a 2.7.5 altre due volte (la provetta di raccolta delle cellule deve avere 6 mL alla fine).
- Trasferire lentamente il contenuto della provetta di raccolta nella provetta a gradiente preparata al punto 2.2, evitando l'interruzione del gradiente.
- A questo punto, togliere dal frigorifero il terreno neurobasale precedentemente preparato (Tabella 1) e lasciarlo scaldare in un bagno a 37 °C.
- Purifica i neuroni.
- Centrifugare la provetta a gradiente per 15 minuti a 800 x g e 22 °C.
- Raccogliere gli strati desiderati con una pipetta (Figura 2) e inserirli in una nuova provetta da 15 mL. Per l'isolamento dei neuroni con la massima purezza (cioè >90%), raccogliere lo strato 3. Per una resa maggiore con una purezza inferiore (ad esempio >70-80%), raccogli gli strati 2 e 3.
- Diluire il gradiente di densità aggiungendo 5 mL di HABG agli strati appena raccolti.
- Centrifugare a 200 x g per 2 min a 22 °C.
- Scartare il surnatante, risospendere in 5 ml di HABG e azionare il pellet per sospendere le cellule.
- Centrifugare a 200 x g per 2 min a 22 °C.
- Scartare il surnatante, risospendere in 3 mL di terreno neurobasale e azionare il pellet per risospendere le cellule.
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| media | immagazzinamento | Ingredienti | preparazione |
| HABG | 4 °C/24h | | 100 mL | - Scongelare B27 in frigorifero a 4 °C O/N
- Sterilizzazione del filtro (0,22 μm) |
| Ibernazione A | 97.8 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0.25 mL |
| Terreni neurobasali | 4 °C/1 settimana | | 100 mL | - Scongelare B27 in frigorifero a 4 °C O/N
- Filtro sterilizzato (0,22 μm)
- Aliquotare porzioni da 50 mL in provette da 50 mL (conservare a 4 °C) |
| Neurobasale A | 97 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0.25 mL |
| Penna/Streptococco [1%] | 1 ml |
| Mezzi di digestione | Giorno di Isolamento | | 10 mL | - Agita vigorosamente
- Lasciare riposare in un bagno a 37°C per 30 minuti (idealmente preparato 30 minuti prima dell'uso)
- Sterilizzazione del filtro (0,22 μm) |
| HA-Ca | 10 mL |
| papaina | 25 mg |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0.025 mL |
| Gradiente di densità | Giorno di isolamento | | 1 Gradiente | |
| Livello | OptiPrep | HABG |
| (0,13 ml) | (5,29 ml) |
| 1 Parte inferiore | 0,26 ml | 1,24 ml |
| numero arabo | 0,19 ml | 1,31 ml |
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml |
| 4 Inizio | 0,11 ml | 1,39 ml |
Tabella 1: Preparazione dei media e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.
