Decellularizzazione del complesso cardiopolmonare: una tecnica per la decellularizzazione di cuore e polmoni da un modello murino

Abstract

Fonte: Mayorca-Giuliani, A. E. et al. Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra un metodo per produrre matrice extracellulare decellularizzata o scaffold ECM applicando la perfusione anterograda di detergenti attraverso il sistema vascolare. Gli scaffold strutturali della ECM possono quindi essere utilizzati per analizzare il rimodellamento della ECM associato alla malattia cardiopolmonare.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Microchirurgia post-mortem

1. Sopprimere il topo utilizzando una camera di CO₂.
   1. Metti il topo in una camera da 4 L e inizia a riempirlo con CO₂ al 100%, iniziando a 0,2 L/min per 2 minuti, aumentando fino a raggiungere un flusso di 0,8 L/min dopo 3 minuti. Il topo dovrebbe perdere conoscenza durante i primi 2 minuti, quindi la respirazione dovrebbe cessare (di solito circa 5 minuti, ma il flusso può essere mantenuto se necessario). Confermare la morte prima di procedere al passaggio successivo.
2. Radere il torace, l'addome e la parte posteriore del topo con il tagliacapelli e disinfettare con etanolo al 70%. La rasatura riduce notevolmente il numero di artefatti dovuti alla presenza di peli su campioni per l'imaging o per l'analisi biochimica.
3. Appunta il topo a un vassoio di polistirolo, estendendo gli arti anteriori e posteriori, così come la testa e la coda. Posizionalo sotto il microscopio per microchirurgia.
4. Utilizzando una forbice a schema dritto Mayo, stabilire l'accesso chirurgico con un'incisione cutanea che va dalla regione sottomandibolare all'addome inferiore e sezionare per via sottocutanea per esporre la parete toracica e il peritoneo.
5. Usando le forbici microchirurgiche, tagliare i muscoli grande pettorale e piccolo pettorale lungo il sesto spazio intercostale su entrambi i lati della parete toracica.
6. Usando le forbici a schema dritto, taglia lo sterno lungo le incisioni precedenti, quindi completa una sternotomia tagliando lo sterno lungo il suo asse lungo, quindi solleva e fissa entrambi i lati della parete toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
7. Utilizzando micro-pinze a punta tonda (o micro-pinze di Dumont), asportare il timo e il tessuto adiposo circostante estraendoli delicatamente dai loro attacchi. Questo rivelerà le navi principali.
8. Usando il cauterio, cauterizzare la vena cava discendente e, usando le forbici a schema dritto, tagliare l'esofago.
9. Utilizzando micro-pinze affilate, separare le vene brachiocefale e le arterie brachiocefalica, carotide comune sinistra e succlavia sinistra dal tessuto sottostante per facilitare la legatura e la cauterizzazione.
10. Utilizzando il porta micro-aghi, le micro-pinze affilate e la sutura 9-0 posizionano i punti sopra l'emergere delle arterie brachiocefalica, carotide comune sinistra e succlavia sinistra.
11. Cauterizzare le vene brachiocefale.
12. Separare le ghiandole salivari sottomandibolari lungo la linea mediana per esporre i muscoli del collo e la trachea. Separare i muscoli per esporre il legamento cricotiroideo. Usando le microforbici, apri un ingresso sezionando il legamento.
13. Introdurre un catetere da 27 G nella trachea e spingere delicatamente fino a quando la trachea non si ramifica nei bronchi (cioè fino a quando non si incontra resistenza al catetere, quindi arretrare di 3 mm). Fai attenzione a non disturbare i bronchi. Utilizzando una sutura 6-0, posizionare 3 punti di sutura attorno alla trachea per fissare il catetere.
14. Sezionare il topo all'altezza della 12a vertebra toracica. L'aorta discendente corre anteriormente alla colonna vertebrale e dovrebbe essere sezionata qui insieme alla colonna vertebrale. Separa la metà inferiore.
15. Cateterizzare retrogradamente l'aorta e spingere il catetere fino a raggiungere l'arco aortico. Utilizzando la sutura 9-0, posizionare 4 punti di sutura attorno all'aorta, iniziando 5 mm sotto la punta del catetere.

2. Decellularizzazione

1. Collegare il mouse a un sistema di pompaggio utilizzando tubi in silicone e connettori Luer. Perfondere con acqua deionizzata a 200 μL/min per 15 min. Mantenere questa velocità di flusso durante la decellularizzazione.
2. Cambiare l'agente di perfusione in desossicolato di sodio (DOC) allo 0,5% diluito in acqua deionizzata e perfondere per una notte.
3. Cambiare l'agente di perfusione con dodecil solfato di sodio allo 0,1% (SDS) diluito in acqua deionizzata e perfondere per 8 ore.
4. Perfondere con acqua deionizzata durante la notte per lavare via SDS e DOC per 24 ore.
5. Resecare il cuore e i polmoni decellularizzati sezionando i suoi attacchi al torace utilizzando una forbice curva e conservarli in una crio-provetta sterile con acqua deionizzata con penicillina-streptomicina all'1% (v/v) e 0,3 μM di sodio azide a 4 °C. Gli scaffold ECM possono essere conservati per almeno 12 settimane. Se l'impalcatura verrà utilizzata per analisi biochimiche (ad es. spettrometria di massa), congelare a colpo d'occhio in azoto liquido.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microchirurgia
Sutura 6-0, ago a sezione triangolare (Vicryl)	Ethicon	6301124
Micro-sutura 9-0 (Safil)	B Braun	G1048611
Pinza Adson	Strumenti per la scienza	Codice: 11006-12
Pinza Adson con denti	Strumenti per la scienza	Codice 11027-12
Porta microaghi Castroviejo	Strumenti per la scienza	Codice 12061-01
Camera di ventilazione CO2 per l'eutanasia del topo
Acqua deionizzata (Milli-Q IQ 7000, sistema di acqua di laboratorio ultrapura)	Merck	ZIQ7000T0
Vaschetta monouso in polistirolo (~30 × 50 cm)
Microscopio da dissezione (Greenough, con collo d'oca a due bracci)	Leica	S6 D
Microspatola a doppia estremità	Strumenti per la scienza	Codice 10091-12
Micropinze Dumont (due)	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20
Micropinze Dumont con punte a 45°	Strumenti per la scienza	Codice 11251-35
Tagliacapelli	Oster	Codice 76998-320-051
Porta aghi Halsey (con ganasce in carburo di tungsteno)	Strumenti per la scienza	Codice: 12500-12
Catetere endovenoso calibro 24 (Insyte)	Bd	381512
Catetere endovenoso calibro 26 (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Forbici Mayo (taglio duro, dritto)	Strumenti per la scienza	Codice: 14110-15
Micropinze con punte ad anello	Esculap	FM571R
Forbici a micromolla (Vannas, curve)	Strumenti per la scienza	Codice 15001-08
Aghi (calibro 27; Microlance)	Bd	21018
Tovagliolo di carta (sterile) o tovagliolo chirurgico
Forbici seghettate (CeramaCut, dritte)	Strumenti per la scienza	Codice: 14958-09
Spatola (Freer-Yasargil)	Esculap	OL166R
Siringhe (1 mL; Plastipak)	Bd	3021001
Siringhe (10 mL; Plastipak)	Bd	3021110
Forbici tendinee (Walton)	Strumenti per la scienza	Codice 14077-09
DECELLULARIZZAZIONE
Etanolo al 70% (alcol assoluto 99,9%); l'alcol assoluto deve essere regolato al 70% (vol/vol) utilizzando acqua deionizzata	prugna	1680766
Acqua deionizzata (Milli-Q IQ 7000, sistema di acqua di laboratorio ultrapura)	Merck	ZIQ7000T0
Raccordi maschio Luer-to-tubing (1/8 di pollice)	Strumenti di precisione mondiali	Codice 13158-100
Raccordi maschio Luer-to-tubing (1/8 di pollice)	Strumenti di precisione mondiali	Codice 13158-100
PBS (pH 7,4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientifico	70011044
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140122
Pompa peristaltica (con 12 canali)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Tubo in silicone (con diametro interno di 2 mm e diametro esterno di 4 mm)	Ole Dich	Telefono 31399
Aziduro di sodio	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Desossicolato di sodio (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G