Isolamento dell'epitelio delle papille circumvallate (CVP) dal modello murino: una procedura enzimatica per separare l'epitelio CVP dalla lingua di topo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Shechtman, L. A. et al. Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, descriviamo l'isolamento dell'epitelio delle papille circumvallate (CVP) da una lingua murina.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Isolamento dell'epitelio CVP

Eutanasia dei topi con asfissia da CO₂ secondo le normative IACUC, seguita da un metodo secondario approvato come toracotomia bilaterale, lussazione cervicale, decapitazione o dissanguamento.
Usa grandi forbici da dissezione sterili per tagliare le guance e rompere la mascella. Sollevare la lingua e tagliare il frenulo linguale per separare la lingua dal pavimento della cavità orale. Taglia la lingua e raccoglila in soluzione salina sterile di Dulbecco tamponata con fosfato ghiacciato (dPBS) con Ca²⁺ e Mg²⁺.
Rimuovere e scartare la lingua anteriore tagliando appena davanti all'eminenza intermolare con una lama di rasoio (Figura 1A, linea tratteggiata). Utilizzare una salvietta delicata per rimuovere i peli e il liquido in eccesso dalla lingua posteriore.
Riempire una siringa da 1 ml con 200-300 μL di soluzione enzimatica per iniezione (concentrazione finale: 2 mg/mL di collagenasi di tipo I e 5 mg/mL di dispasi II in Ca²⁺/Mg²⁺-contenente dPBS, diluito da 10 mg/mL di soluzioni madre) e inserire un ago da 30 G x 1/2 appena sopra l'eminenza intermolare (Figura 1B, freccia nera) fino a poco prima del CVP (Figura 1B, riquadro nero). Iniettare la soluzione enzimatica sotto e ai bordi laterali del CVP tra l'epitelio e i tessuti sottostanti (lamina propria, muscolo). Estrarre la siringa lentamente e continuamente dalla lingua durante l'esecuzione dell'iniezione.
Incubare la lingua in Ca²⁺/Mg²⁺-dPBS free a temperatura ambiente per esattamente 33 min.
Praticare piccoli tagli nell'epitelio bilateralmente e appena anteriormente al CVP usando forbici da dissezione extra fini e sbucciare delicatamente l'epitelio sollevandolo con una pinza fine. Una volta che l'epitelio della trincea è libero dal tessuto connettivo sottostante, posizionarlo in una provetta da microcentrifuga vuota da 2 ml pre-rivestita con FBS. Eseguire il taglio epiteliale prima o dopo il distacco dell'epitelio CVP (Figura 1C, D).

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Risultati

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Figura 1: Lingua sezionata ed epitelio CVP sbucciato. (A) La lingua viene sezionata e la lingua anteriore viene rimossa tagliando appena anteriormente all'eminenza intermolare (linea tratteggiata), lasciando la lingua posteriore, che include il CVP (scatola nera) (B) Un ago viene inserito appena anteriormente all'eminenza intermolare (freccia nera) e ...