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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle microbolle
- Preparazione delle microbolle per l'iniezione
nota: L'assistente esegue questa fase quando viene avviata l'"Iniezione di microbolle (MB) negli embrioni". Ogni embrione viene iniettato una volta, con il tipo di microbolla scelto per ogni iniezione che viene selezionato casualmente dall'assistente in modo che tutti i tipi di microbolle siano distribuiti uniformemente durante la procedura ma somministrati in ordine casuale. Assicurarsi che il chirurgo non sia in grado di notare il tipo di bolla che viene iniettata.
- Determinare il volume della soluzione madre di bolle necessario per produrre una concentrazione finale di 1 x 108 MB/mL in un volume di 400 μL (calcolare il volume utilizzando le concentrazioni stock). Aliquotare il volume corrispondente di soluzione fisiologica in una provetta da microcentrifuga vuota.
- Agitare delicatamente il flaconcino di microbolle selezionato e aspirare un volume in eccesso (~50 μL maggiore di quello calcolato sopra) della soluzione in una siringa da 1 mL utilizzando l'ago da 21 G. Iniettare le microbolle in una provetta da microcentrifuga vuota.
- Pipettare il volume necessario di soluzione madre a microbolle e aggiungerlo all'aliquota di soluzione fisiologica. Mescolare mescolando delicatamente con la punta della pipetta.
- Aspirare la soluzione di microbolle diluita in una siringa pulita utilizzando l'ago da 21 G. Rimuovendo l'ago, eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa e collegare il luer e il tubo. Spingere lentamente la soluzione fino all'estremità del tubo facendo attenzione a non generare bolle d'aria.
- Inserire la siringa in una pompa per infusione a siringa impostata per erogare le microbolle a una velocità di 20 μl/min per un volume totale di 20 μl. Collegare un ago di vetro tirato all'estremità del tubo. Avvicinare la pompa allo stadio di iniezione.
2. Iniezione di microbolle negli embrioni
- Seleziona e rimuovi casualmente (con un cucchiaio perforato) un embrione dal piatto di terreno refrigerato. Posizionare nella capsula di dissezione situata sul tavolino ad ultrasuoni sotto lo stereoscopio e rimuovere il sacco vitellino e le membrane amniotiche con la pinza fine, tagliando/strappando dal lato che appare meno vascolarizzato (il lato antimesometriale). Ciò si ottiene più facilmente perforando un'area adiacente alla regione della testa.
- Taglia abbastanza per rimuovere l'embrione dall'interno, ma non di più. Stabilizzare le piastre di dissezione utilizzando piccoli pezzi di plastilina.
- Manovrare delicatamente la sacca intorno all'embrione. Posiziona l'embrione su un fianco, con la placenta e i vasi ombelicali davanti. Usando gli spilli per insetti, appuntare il sacco vitellino (si consigliano 4 spilli) e i bordi della placenta se necessario per fissarli in posizione. Evita le navi più grandi.
- Lavare l'embrione con PBS preriscaldato a 45°C fino a quando l'embrione non si rianima. Identificare la vena ombelicale e la rete vascolare associata. Posizionare la capsula in modo che l'iniezione possa essere eseguita comodamente.
nota: Una volta riscaldato, il sangue nell'embrione inizierà a fluire, pompando visibilmente nell'arteria ombelicale. Quando inizia il flusso, le vene saranno di un rosso vivo, con il sangue in entrambi i vasi che apparirà rapidamente identico. I rami che derivano dalla vena ombelicale di solito si sovrappongono a quelli dell'arteria ombelicale sulla superficie placentare.
- Una volta che l'embrione si è rianimato, coprilo (ma non la placenta) con gel americano preriscaldato, assicurandoti di rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria (usando la pinza fine) intorno all'embrione. Rabboccare il piatto con PBS preriscaldato.
nota: Tenere d'occhio il livello di soluzione nelle siringhe PBS e gel e aggiungere siringhe di riserva al becher riscaldante, se necessario.
- Montare l'ago di vetro su una grossa palla di plastilina sul bordo del piatto di dissezione e inserire l'estremità dell'ago nel PBS. Scegliendo una vena sulla superficie corionica del disco placentare, il più lontano possibile dal ramo principale, tagliare la punta a misura usando le forbici. L'iniezione è più semplice se la punta viene tagliata con una leggera angolazione. Rimuovere eventuali bordi frastagliati del vetro utilizzando il bordo delle forbici a molla.
- Utilizzando la pompa a siringa, iniettare lentamente la soluzione di microbolle a 20 μL/min nell'ago di vetro fino a quando tutta l'aria viene espulsa dalla punta dell'ago e si possono vedere le microbolle fluire liberamente nel PBS. Arrestare la pompa e reimpostare per un volume di iniezione di 20 μl. Non permettere all'aria di entrare nel sistema vascolare dell'embrione durante l'iniezione.
- Inserire delicatamente la punta dell'ago di vetro in una delle vene della placenta e assicurarsi che sia immobile. Spostare la testa dello stereoscopio e posizionare il trasduttore sopra l'embrione. Avviare l'imaging.