Isolamento dei batteri commensali congiuntivali basato su tampone: una tecnica per isolare i batteri commensali dalla congiuntiva del modello murino

Abstract

Fonte: Smith-Page, K. et al. Isolamento commensale congiuntivale e identificazione nei topi. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video descrive una tecnica basata su tampone per isolare batteri commensali vitali dalla congiuntiva oculare. La tecnica può essere utilizzata per profilare il microbioma batterico commensale della congiuntiva, che svolge un ruolo difensivo contro i patogeni.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del tampone oculare, impostazione del campo di lavoro, tampone oculare del topo e arricchimento del campione

1. Preparare tamponi oculari sterili
   nota: I tamponi oculari sterili sono stuzzicadenti in legno rivestiti sottilmente con uno strato sottile di fibra di ovatta di cotone e realizzati in casa.
   1. Autoclavare in autoclave una quantità adeguata di ovatta di cotone e stuzzicadenti per il numero di topi da tamponare.
   2. Pizzica un pezzo di ovatta di cotone lungo mezzo centimetro con il pollice e l'indice. Stuzzicare l'imbottitura tirando i bordi con i pollici e gli indici per formare un unico strato poroso piatto, fermandosi appena prima che l'imbottitura si sfaldi (sono accettabili piccoli pezzi di cotone sparsi in tutta l'imbottitura allungata).
   3. Agitare l'imbottitura attorno a una delle estremità affilate dello stuzzicadenti tenendo leggermente il pezzo allungato sulla punta dello stuzzicadenti mentre viene attorcigliato, vedere la Figura 1. Il tampone oculare "completato" avrà uno strato molto sottile di cotone teso sulla punta, che si estende da circa mezzo a un centimetro di distanza dalla punta.
   4. Inserire i tamponi "completati" nel piccolo becher, con il lato del tampone rivolto verso il basso e coprire. Autoclave.
2. Configurare l'area di lavoro
   1. Preparare l'anestesia contenente 2 ml di ketamina (100 mg/mL), 400 μL di xilazina (100 mg/mL) e 27,6 ml di soluzione fisiologica sterile (0,9% NaCl in dH₂O) in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL. Sterilizzare con filtro e aliquotare l'anestesia per l'uso immediato (può essere conservato a 4 °C per 1 mese; lasciare sempre equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso).
   2. Svuotare e pulire l'area di lavoro con disinfettante per ridurre al minimo la contaminazione.
   3. Aliquotare 0,5 mL di terreno sterile per infusione cerebrale cardiaca (BHI) in provette per microcentrifuga sterili da 1,5 mL marcate (1 provetta per topo e controllo); disporle in un rack per microcentrifuga. Metti la griglia sul ghiaccio.
   4. Impostare il flusso di lavoro come segue (da sinistra a destra): stazione di anestesia per topi (gabbia contenente topi sperimentali, gabbia sterile vuota, anestesia a temperatura ambiente, ago da 25 G e siringa da 1 mL), stazione di tampone oculare (BHI aliquotato su ghiaccio, tamponi oculari sterilizzati, salviette di carta pulite, spray isopropanolo al 70%) e stazione di placcatura (piastre di agar sanguigno a temperatura ambiente, pipetta da 10 μL, Puntali monouso sterili da 10 μl, contenitore per rifiuti a rischio biologico).
3. Tampone oculare
   1. Somministrare 10 μL di anestesia per 1 g di peso del topo, dosaggio di ketamina e xilazina rispettivamente per via intraperitoneale a ciascun topo adulto e metterlo in una gabbia autoclavata. Testare l'anestesia premendo il cuscinetto del retropiede; Nessun movimento indica un'anestesia appropriata.
   2. Assegna una mano per maneggiare solo i topi anestetizzati e l'altra mano per maneggiare solo il tampone oculare e la coltura. Per il tampone, rimuovere il topo completamente anestetizzato dalla gabbia; Posizionare sopra il piano di lavoro pulito posizionato su un lato con l'occhio sinistro esposto. Spruzzare le mani guantate con isopropanolo, asciugare con un tovagliolo di carta pulito.
   3. Stappare la provetta per microcentrifuga BHI specificamente etichettata con una mano dedicata per la manipolazione dei supporti. Riposizionare la provetta nella griglia della microcentrifuga con ghiaccio. Immergere la punta rivestita di cotone del tampone oculare in BHI, estrarre il tampone oculare dalla provetta facendo roteare la punta 2 volte contro la provetta per rimuovere il liquido in eccesso.
   4. Con la mano che maneggia il mouse, tieni delicatamente il mouse per la collottola. Con l'altra mano, posizionare la punta del tampone oculare contro la regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro, vedere la Figura 2A. Premere leggermente il bulbo oculare e muovere il tampone con un movimento di lavaggio della finestra (Figura 2B) avanti e indietro, tra la palpebra inferiore e l'occhio, 10 volte. Mantenere una pressione costante.
   5. Senza toccare il pelo, rimuovere delicatamente la punta del tampone, perpendicolare al punto in cui è stato inserito, e posizionare il tampone con il lato di cotone rivolto verso il basso direttamente in una provetta da microcentrifuga etichettata contenente terreni BHI. Applicare un collirio lubrificante sull'occhio tamponato.
   6. Rimetti il mouse nella gabbia.
   7. Lasciare riposare il tampone per 10-15 minuti sul ghiaccio e rimuovere il tampone oculare con la mano guantata sterilizzata mescolando la punta nel terreno per 10 rotazioni. Estrarre il tampone facendo roteare la punta contro la parete interna della provetta per microcentrifuga per 5 rotazioni. Smaltire il tampone in un contenitore a rischio biologico.
   8. Ripetere i passaggi da 1.3.2 a 1.3.7 per ciascun topo e per i campioni di controllo (tampone di pelle o pelo). Sterilizzare i guanti in modo appropriato tra ogni tampone.
4. arricchimento
   1. Arricchire il campione incubando la provetta staticamente per 1 ora a 37 °C
   2. Durante l'incubazione, etichettare una tripticasi di soia a temperatura ambiente con il 5% di piastra di agar di sangue di pecora (piastra TSA) per topo e dividere a metà.
   3. Dopo l'incubazione della coltura con tampone oculare, rimuovere i campioni arricchiti dall'incubatore e metterli su ghiaccio.
   4. Brevemente i campioni a vortice da miscelare e placcare secondo lo schema in Figura 3A. Aliquotare 10 μl del campione sulla piastra TSA e inclinare la piastra per formare una striscia, ripetere 2 volte.
   5. Sull'altro lato della linea di demarcazione della piastra, versare 10 μL di campione sull'agar e ripetere 9 volte.
   6. Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore, 2 giorni e 4 giorni (in una camera pulita che impedisca l'essiccazione delle piastre di agar). Contare le colonie in strisce, annotare la morfologia e calcolare le unità formanti colonie (CFU) per tampone per isolati morfologicamente simili. Guarda i punti per organismi unici non catturati in strisce.

Risultati

Figura 1: Tampone oculare interno.
(A) Un sottile pezzo di ovatta di cotone tirato di circa 1 cm veniva tenuto tra la punta sterile dello stuzzicadenti e l'indice e lo stuzzicadenti veniva arrotolato mantenendo una leggera pressione contro l'indice fino a quando il cotone non era completamente arrotolato sulla punta dello stuzzicadenti. (B) Esempi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Puntale per pipetta da 0,1 a 10 μl	Stati Uniti d'America Scientific	1110-300	Autoclave prima dell'uso
Pipetta Eppendorf da 0,5 a 10 μl	Fisher Scientifico	Codice 13-690-026
Siringa da 1 ml	Fisher Scientifico	BD309623	1 siringa per ogni gruppo di tampone oculare
Provette Eppendorf da 1,5 ml	Stati Uniti d'America Scientific	1615-5500	Autoclave prima dell'uso
Puntale per pipetta da 1000 μ ml	Stati Uniti d'America Scientific	Periodo 1111-2021	Autoclave prima dell'uso
Pipetman Gilson da 200 a 1000 μl (P1000)	Fisher Scientifico	F123602G
Ago da 25 g	Fisher Scientifico	14-826AA	1 ago per gruppo di tampone oculare
3 % Perossido di idrogeno	Fisher Scientifico	Episodio 25359
Incubatore a 37 ° C	Attrezzature da laboratorio
70 % Isopropanolo	Fisher Scientifico	PX1840-4
Iniezione Ana-Sed (Xilazina 100 mg/ml)	Santa Cruz Salute degli animali	SC-362949Rx
Bruciatore Bunsen	Attrezzature da laboratorio
Asciugamani di carta puliti	Attrezzature da laboratorio
Cotone Imbatta/Cotone arrotolato sterile	CVS
Ketamina (100 mg/ml)	Henry Schein	9950001
topi	Laboratori Jackson	C57/BL6J
Piastre di Petri	Fisher Scientifico	08-757-12	Per Piastre di agar al sale di mannitolo
RPI Brain Cuore Infusion Media	Fisher Scientifico	Codice: 50-488525	Preparare secondo le indicazioni e in autoclave
SteriFlip (solfone di poliestere con pori di 0,22 μm)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Per sterilizzare l'anestesia
Gabbia per topi sterile	Attrezzature da laboratorio
Stuzzicadenti (bambù rotondo)	Elementi essenziali per la cucina		Autoclave prima dell'uso e preparazione del tampone
Tritticasi Agar di Soia II con il 5% di Placche di Sangue di Pecora	Fisher Scientifico	4321261	Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso
Collirio monouso	Farmacia CVS		Bausch e Lomb Lenithe Lubrificante Collirio, 28 fiale, 0.02 fl oz.