$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Protocollo EHS
- La notte prima del protocollo EHS, posizionare il topo nella camera ambientale a temperatura ambiente (~25 °C, ≈30% di umidità relativa) per acclimatarsi alla camera.
- Utilizzare un sistema di acquisizione dati per raccogliere la temperatura interna continua (Tc), calcolata in media su intervalli di 30 s durante la notte.
- La mattina del protocollo EHS, assicurarsi che il mouse sia pari o inferiore a un intervallo normale di temperatura diurna prima di aumentare la temperatura della camera (ad esempio, 36-37,5 °C). Ciò garantisce che il topo non abbia la febbre e non abbia subito uno stress eccessivo durante questo periodo.
- Una volta che il topo è stabile e si trova entro un intervallo di normale temperatura interna a riposo, rimuovere il cibo e l'acqua e pesare l'animale. Chiudere lo sportello della camera e aumentare la temperatura della camera fino a un obiettivo di 37,5 °C e 40%–50% di umidità relativa, o alla temperatura e all'umidità ambientali desiderate. Verificare la temperatura e l'umidità della camera con un monitor di temperatura e umidità calibrato.
- Circonda la camera con una tenda oscurante per ridurre al minimo la luce e i disturbi durante il protocollo. Monitora continuamente il mouse durante il protocollo tramite telecamere remote illuminate a infrarossi. Metti a fuoco una seconda telecamera sul monitor di temperatura e umidità, posizionato vicino alla ruota di corsa. Apportare eventuali modifiche al controller per il setpoint della camera climatica per garantire letture accurate della temperatura vicino all'animale.
- Una volta che la camera ha raggiunto la temperatura target misurata dalla seconda telecamera sul monitor della temperatura (questo può richiedere ~30 minuti), aprire rapidamente lo sportello della camera e posizionare il mouse nella rotella di corsa forzata.
- Avviare il protocollo del volante a scorrimento forzato a una velocità di 2,5 m/min e aumentare la velocità di 0,3 m/min ogni 10 minuti fino a quando il mouse non raggiunge una Tc di 41 °C. Una volta che il mouse ha raggiunto questa temperatura interna, lasciare che la velocità rimanga costante fino alla limitazione dei sintomi, caratterizzata da un'apparente perdita di coscienza, una caduta all'indietro o uno svenimento e l'incapacità di continuare a correre o di tenersi alla rotellina. Confermare questo punto temporale quando il mouse ha tre rotazioni all'indietro sulla rotellina senza segni di una risposta fisica. In alternativa, identificare un endpoint umano seguendo le regole IACUC locali per determinare quando interrompere il protocollo (ad esempio, quando Tc ~43 °C). Questo endpoint è leggermente al di sopra della limitazione dei sintomi in quasi tutti i topi.
- Per eseguire il protocollo di raffreddamento rapido (R), una volta che il mouse raggiunge la limitazione dei sintomi, arrestare la rotellina e rimuoverla immediatamente dalla rotellina a corsa forzata. Pesa il topo e rimettilo nella sua gabbia domestica per riprenderlo a temperatura ambiente. Durante questo periodo, lasciare aperto lo sportello della camera e riportare il set point dell'incubatore a temperatura ambiente per consentire alla camera di raffreddarsi rapidamente. Questa procedura si traduce in una sopravvivenza a lungo termine del >99%.