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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione del mouse
- Anestetizzare il topo
- Preparare il pentobarbital sodico (50 mg/kg) in una siringa.
- Afferra il topo (maschio di 8 settimane C57BL/6) con la mano sinistra in modo che la sua pancia sia rivolta verso l'alto e la sua testa sia più bassa della coda. Disinfettare la pelle addominale con alcol al 75%.
- Tenendo la siringa nella mano destra, perforare la linea bianca dell'addome con l'ago leggermente sul lato destro della pelle di 3-5 mm. Assicurarsi che l'ago della siringa e la pelle siano a un angolo di 45°, iniettare lentamente il pentobarbital nella cavità addominale. Dopo la rasatura, disinfettare 3 volte intorno al sito di incisione del topo alternativamente con alcol al 75% e soluzione di clorexidina.
- Verificare se l'anestesia ha avuto successo per mancanza di un riflesso raddrizzante.
- Iniettare l'isotiocianato-destrano di rodamina B nella vena caudale.
- Preparare 100 μL di 10 mg/mL di isotiocianato-destrano di rodamina B in una siringa.
- Pulisci la coda del topo con alcool al 75%.
- Tenere la coda con la mano sinistra, tenere la siringa con la mano destra con l'ago parallelo alla vena e iniettare il colorante da 100 μl.
- Arrestare l'emorragia con un batuffolo di cotone dopo l'iniezione.
- Immergere il pelo addominale del topo con una garza bagnata con acqua sterile, e radere l'addome del topo usando un rasoio, facendo dei tratti nella direzione del pelo. Dopo la rasatura, disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con alcol al 75% e soluzione di clorexidina.
- Dopo aver pulito un termoforo con alcol al 75%, apri il termoforo e posiziona il mouse sul retro del termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
2. Riparare il fegato del topo con il telaio per l'imaging degli organi del corpo
NOTA: Il fotogramma commerciale per l'imaging dell'organo non è ancora stato rilasciato.
- Posizionare una ventosa pulita in una posizione fissa.
- Installare un dispositivo di imaging degli organi (Figura 1) e pulire il termoforo e la ventosa con alcol al 75%.
- Collegare la ventosa (diametro 5 mm) al tubo flessibile della pompa del vuoto e accendere la pompa del vuoto.
- Su un tavolo sterile sterilizzato con alcol al 75%, disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con alcol al 75% e soluzione di clorexidina, quindi disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con alcol al 75% e soluzione di clorexidina, quindi usa le forbici chirurgiche per tagliare 2 cm di pelle dal bordo sternale inferiore del topo ed esporre il fegato.
- Posizionare il mouse insieme al termoforo sulla base del supporto.
- Regolare il dispositivo di imaging dell'organo in modo che la ventosa trattenga il fegato. Quindi utilizzare una pressione negativa di 30-35 kPa per l'aspirazione in modo che il fegato si attacchi alla ventosa (Figura 2).
3. Regolazione del microscopio a scansione laser multifotone
- Accendere il microscopio multifotone e selezionare l'obiettivo 60x/1,00 W.
- Fissare la cornice e il mouse sotto la lente dell'obiettivo.
- Aggiungi una goccia di soluzione fisiologica normale che possa coprire l'intera lente, che è il centro della ventosa, e regola la lente dell'obiettivo in modo che tocchi appena la soluzione salina normale.
- Fare doppio clic sull'icona del computer per accendere il software laser e accendere l'interruttore. Quindi tenere premuto il pulsante di accensione e l'otturatore per 3 s.
- Impostare la lunghezza d'onda su 800 nm.
- Avviare il software operativo del microscopio utilizzando il computer.
- Per l'impostazione dell'acquisizione, impostare Laser 800.
