Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'apparecchio per soluzioni e perfusione
- Assemblare un apparecchio di Langendorff a flusso costante (disponibile in commercio o autocostruito). La Figura 1 fornisce un semplice schema.
- Preparare le soluzioni secondo i reattivi riportati nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
- Aprire il bagnomaria di ricircolo e regolare una temperatura di ingresso adeguata (42,7 °C nel nostro laboratorio) per garantire che il deflusso del sistema di circolazione del perfusato dalla cannula raggiunga i 37 °C.
- Pulire il sistema di perfusione facendo circolare acqua deionizzata. Se è richiesta una condizione sterile, far scorrere l'etanolo al 75% attraverso il sistema di perfusione per 15 minuti, seguito da acqua deionizzata (almeno 10 cicli per evitare effetti di tossicità dell'alcol sul cuore).
- Misurare il tempo e il volume per un ciclo del sistema di circolazione del perfusato per determinare quanti millilitri di soluzione ossigenata di Tyrode devono essere caricati nella successiva fase di perfusione.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con il metodo desiderato.
- Impostare la velocità di flusso del sistema di perfusione perfusato a 4 mL/min.
- Prepara due piastre di Petri da 35 mm pulite, una contenente la soluzione di Tyrode (piastra di Petri 1) e l'altra contenente la soluzione 1 (piastra di Petri 2).
- Preparare una siringa da 1 ml riempita con la soluzione 1 e un ago per cannula in acciaio smussato da 20 G con una tacca da dove la distanza è di 1 mm dalla punta. Preparare un nodo sciolto con sutura 3-0 allo stelo della cannula. Regolare il campo di visualizzazione dello stereomicroscopio e assicurarsi che la punta della cannula si trovi al di sotto della superficie del liquido della piastra di Petri 2.
2. Preparazione degli animali
- Somministrare eparina (concentrazione, 1.000 UI/mL; 0,2 mL/topo) per via intraperitoneale ai topi per evitare coaguli di sangue. Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con pentobarbital di sodio (50 mg/kg, iniezione I.P.) e assicurarsi che i topi smettano di rispondere ai pizzicamenti della coda/delle dita. Eseguire la lussazione cervicale 20 minuti dopo la somministrazione di eparina.
- Trasferire i topi sulla piattaforma chirurgica, fissare i topi in posizione supina, sterilizzare il torace con etanolo al 75% e asciugarlo con una garza o un tovagliolo.
3. Escissione cardiaca e incannulamento dell'aorta
- Sollevare la pelle dello xifoide con una pinza per tessuti e praticare una piccola incisione laterale attraverso la pelle con le forbici per tessuti. Eseguire una dissezione smussata tra la pelle e la fascia ed estendere l'incisione della pelle a forma di V verso le ascelle su entrambi i lati.
- Continua la stessa traccia di incisione attraverso la gabbia toracica, quindi devia la gabbia toracica verso l'alto bloccando lo sterno con una pinza per tessuti per esporre completamente il cuore e i polmoni.
- Staccare il pericardio usando una pinza curva. Strappare la ghiandola del timo verso entrambi i lati con due pinze curve se copre i grandi vasi. Tirare delicatamente la base del cuore verso la coda con una pinza curva fino a quando non si vede un vaso sanguigno a forma di "Y" (l'aorta e le sue arterie ramificate).
- Per riservare diverse lunghezze dell'aorta per l'incannulamento e il confronto, sezionare l'aorta all'arteria carotide comune sinistra (linea verde nella Figura 2) e tagliare contemporaneamente l'arteria brachiocefalica in alcuni topi. Transetto all'aorta ascendente in altri topi (linea nera nella Figura 2).
nota: Per coloro che sono nuovi a questa procedura, questo passaggio può essere eseguito anche al microscopio stereoscopico.
- Asportare il cuore e immergerlo immediatamente nella capsula di Petri 1 per lavare e pompare il sangue residuo.
- Trasferisci il cuore nella piastra di Petri 2 e taglia il tessuto in eccesso usando le forbici per iride fine, se necessario. Per coloro che sono nuovi a questa procedura, eseguire questo passaggio sotto lo stereomicroscopio per evitare di tagliare erroneamente l'aorta o altre strutture cardiache.
- Spingere la siringa per espellere le bolle d'aria prima dell'incannulamento dell'aorta. Eseguire l'incannulamento dell'aorta retrograda con l'assistenza di due pinze di legatura diritte (mascelle lisce) sotto lo stereomicroscopio. Assicurarsi che l'intero processo di incannulamento sia sotto la superficie del liquido.
- Evitare di penetrare nelle valvole aortiche e regolare le profondità all'aorta ascendente (il topo che l'aorta è stata sezionata all'arteria carotide comune sinistra) e alla radice aortica (il topo in cui l'aorta è stata sezionata all'aorta ascendente), rispettivamente.
nota: La profondità dell'incannulamento dell'aorta (indicata semplicemente come profondità) è qui definita come la posizione in cui la punta della cannula si trova nell'aorta o dove l'aorta è legata.
- Legare l'aorta con la sutura pre-nodo 3-0 alla tacca della cannula. Premere delicatamente il contenuto della siringa per sciacquare il sangue residuo.
nota: Il sangue lascerà le arterie coronarie e fuoriuscirà dalle vene dorsali se la profondità è posizionata correttamente. Il cuore e le appendici atriali si espanderanno e diventeranno pallidi.
- Rimuovere e collegare la cannula all'apparecchio Langendorff. Ancora una volta, fai attenzione a evitare che bolle d'aria entrino nel cuore.
nota: Tenere presente che il tempo dalla toracotomia alla perfusione iniziale non deve superare i 5 minuti.
- Per la perfusione cardiaca, primeggiare e perfondere la soluzione ossigenata di Tyrode per circa 10 s (il volume di liquido che scorre per 10 s nel sistema utilizzato in questo protocollo è di circa 0,7 mL) se c'è sangue residuo negli atri, quindi passare alla soluzione 1. Tuttavia, è sufficiente perfondere con la soluzione 1 se non c'è sangue residuo negli atri. Perfondere il cuore per circa 2 min.
Tabella 1. Soluzioni per l'isolamento CM di topi adulti.
| soluzione | Sommario (concentrazione finale in mmol/L, se non diversamente specificato) | rinomato |
| Soluzione di perfusione (soluzione 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurina, 5 Glucosio, 10 2,3-butandione monoxime (BDM) | Che può essere conservato per 3 giorni a 4 °C. Glucosio, Taurina e BDM vengono aggiunti il giorno dell'esperimento. Preparare 200 ml di soluzione di perfusione per ogni cuore. |
| Soluzione di Tyrode (soluzione 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 glucosio | Che può essere conservato per 3 giorni a 4 °C. CaCl2 e glucosio vengono aggiunti il giorno dell'esperimento, regolare il pH a 7,3-7,4 con NaOH saturo a temperatura ambiente (28-30°C) con un misuratore di pH. |
Tabella 2. Soluzioni per l'isolamento e la conservazione di CM su topi adulti.
| soluzione | contenuto | rinomato |
| Soluzione di digestione (soluzione 3) | 25 mL di soluzione 1, 6μL 100 mM/L di CaCl2, 25 mg di collagenasi II, 50 μL (2,5 % 10×) di tripsina | Per ogni cuore |
| Soluzione di arresto 1 (soluzione 4) | 9 mL di soluzione 1, 1 mL di FBS (siero fetale bovino), 4μL 100 mM/L di CaCl2 | Per ogni cuore |
| Soluzione di arresto 2 (soluzione 5) | 9,5 mL di soluzione 1, 0,5 mL di FBS (siero fetale bovino), 4μL 100 mM/L di CaCl2 | Per ogni cuore |
| Soluzione di risospensione cellulare (soluzione 6) | 13 mL di soluzione 1, 7μL 1M/L di CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) a una dose che può formare uno strato sottile che copre la superficie del liquido | Per ogni cuore |
