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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione e intubazione dei topi
- Anestetizzare giovani topi C57B1/J6 (20-25 g) mediante inalazione di sevoflurano all'8% con 0,5-1,0 L/min 100% O2 in un tubo a cono.
- Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di ritiro del pizzico delle dita dei piedi.
- Posizionare il topo in decubito dorsale su una piastra inclinata e procedere all'intubazione orotracheale.
- Spostare il mouse sul termoforo e collegare rapidamente il tubo orotracheale al ventilatore per avviare la ventilazione meccanica.
- Regolare i parametri del ventilatore su una frequenza di 160 respiri/min e un volume corrente di 10 mL/kg.
2. Preparazione per l'intervento chirurgico (sia per gli interventi di bendaggio che per quelli di debanding)
- Radersi e applicare la crema depilatoria dalla scollatura fino al livello del torace dei topi.
- Applicare il gel oftalmico sugli occhi degli animali per evitare che la cornea si secchi.
- Posizionare una sonda rettale e l'ossimetro sulla zampa o sulla coda per monitorare rispettivamente la temperatura, l'ossigenazione del sangue e la frequenza cardiaca.
NOTA: L'anestesia induce una significativa ipotermia, pertanto è importante mantenere la normale temperatura corporea durante l'intervento chirurgico per evitare una rapida diminuzione della frequenza cardiaca.
- Mantenere l'anestesia con sevoflurano (2,0-3,0%). Controllare il corretto livello di anestesia in base alla mancanza del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
- Posizionare i topi in decubito laterale destro su un termoforo e fissare gli arti al sistema di retrazione del fissatore magnetico con un nastro adesivo per mantenere l'animale nella posizione corretta durante l'intervento chirurgico (Figura 1, Figura 2A).
- Disinfettare il torace del topo con alcol al 70% seguito da una soluzione di iodio povidone.
3. Chirurgia del bandetto aortico ascendente
- Con una lama monouso, eseguire una piccola incisione cutanea (~0,5 cm) sul lato sinistro, immediatamente sotto il livello dell'ascella, e sezionare la pelle.
- Sezionare delicatamente e separare il muscolo pettorale e gli altri strati muscolari fino a quando le costole diventano visibili. Usa una pinza fine ed evita di tagliare il muscolo.
- Al microscopio, identificare gli spazi intercostali e praticare una piccola incisione tra il 2° e il 3° spazio intercostale con una pinza fine.
- Ritrarre le costole posizionando il divaricatore toracico (Figura 1A).
- Utilizzare piccole pinze per sezionare delicatamente e separare i lobi timici fino a quando l'aorta ascendente diventa visibile.
nota: Gli applicatori di cotone dovrebbero essere utili in caso di sanguinamento. In caso di sanguinamento significativo (ad esempio, l'arteria mammaria) deve essere somministrata soluzione fisiologica calda e sterile.
- Utilizzare una piccola pinza per sezionare delicatamente l'aorta.
NOTA: L'aorta è considerata sezionata quando non ci sono grasso o altre aderenze intorno ad essa ed è possibile circondare facilmente il vaso con una piccola pinza curva.
- Dopo la dissezione aortica, posizionare una legatura in polipropilene 7-0 attorno all'aorta utilizzando un ausilio di legatura e una pinza curva (Figura 1B).
- Posizionare l'ago smussato da 26 G parallelamente all'aorta (punta rivolta verso la testa del topo) (Figura 1B). Per i topi di peso compreso tra 20 e 25 g, questo ago induce una costrizione aortica riproducibile del 65-70%.
- Fai 2 nodi sciolti attorno all'aorta e all'ago da 26 G con l'aiuto di 2 pinze (Figura 1B).
- Stringere il 1° nodo e, subito dopo, il 2° nodo. Confermare brevemente il corretto posizionamento della costrizione e rimuovere rapidamente l'ago per ripristinare il flusso sanguigno aortico. Infine, fare un 3° nodo (gruppo BA).
- Riposizionare il timo e i muscoli nella loro posizione iniziale.
- Eseguire la procedura sham identica alla procedura di costrizione ma mantenendo la sutura libera attorno all'aorta (gruppo SHAM).
- Tagliare le estremità della sutura e rimuovere il divaricatore toracico.
NOTA: Le estremità corte della sutura possono aumentare la probabilità che i nodi si allentino con la pressione aortica, mentre le estremità lunghe rendono la procedura di debanding più rischiosa poiché possono verificarsi aderenze tra la sutura e l'atrio sinistro.
- Chiudere la parete toracica utilizzando una sutura in polipropilene 6-0 con una sutura semplice interrotta o continua utilizzando il minor numero possibile di punti. Stringere l'ultimo nodo toracico con i polmoni gonfiati alla fine dell'inspirazione pizzicando il deflusso del ventilatore per 2 secondi per rigonfiare i polmoni.
- Chiudere la pelle con una sutura 6-0 in seta/polipropilene in uno schema di sutura continuo.
NOTA: Se si utilizza un ventilatore più recente, è possibile programmarlo per mettere in pausa l'inspirazione (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
4. Assistenza post-operatoria
- Applicare la soluzione di iodio povidone sul sito di sutura cutanea.
- Per una corretta analgesia, somministrare buprenorfina per via sottocutanea 0,1 mg/kg, due volte al giorno, fino a quando l'animale non si riprende completamente (di solito 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico).
- Iniettare soluzione fisiologica sterile per via intraperitoneale per prevenire la disidratazione in caso di sanguinamento significativo durante l'intervento chirurgico.
- Spegnere l'anestesia (senza deintubare il topo) e attendere che l'animale recuperi i riflessi (i movimenti dei baffi sono un segnale di risveglio) e inizi a respirare spontaneamente.
- Rimuovere la cannula tracheale.
- Lasciare che l'animale si riprenda in un'incubatrice a 37 °C.
- Riportare l'animale in una stanza per cicli luce/buio di 12 ore dopo il completo recupero.
5. Chirurgia del Debanding Aortico
- Sette settimane dopo, eseguire il debandamento dell'aorta in metà degli animali BA.
- Ripetere tutti i passaggi da 1.1 a 2.6 menzionati sopra.
- Sezionare delicatamente i tessuti, le aderenze e la fibrosi intorno all'aorta fino a quando la sua costrizione diventa visibile.
- Sezionare con cura l'aorta e separare la sutura dall'aorta. Tagliare la sutura con forbici a molla angolate con una sonda (Figura 2B).
- Chiudere la parete toracica utilizzando una sutura in polipropilene 6-0 con una sutura semplice interrotta o continua utilizzando il numero minimo di punti di sutura possibile.
NOTA: Provare a stringere l'ultima sutura toracica quando i polmoni sono gonfiati per evitare lo pneumotorace.
- Chiudere la pelle con una sutura 6-0 in seta/polipropilene in uno schema di sutura continuo.
- Eseguire tutte le procedure di cura post-operatoria come indicato nel passaggio 4.
