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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Preparazione della soluzione di colorante blu di metilene
- Misurare 0,1 g di polvere di blu di metilene.
- Sciogliere completamente il blu di metilene in 10 mL di soluzione fisiologica normale o in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante vortex.
- Filtrare la soluzione di blu di metilene 10 mg/mL con un filtro per siringa (dimensione dei pori della membrana 0,45 μm) per eliminare l'ostruzione durante l'iniezione.
- Assemblare un set sterile per le vene del cuoio capelluto (27 G x 3/4") con una siringa monouso da 3 ml e riempire la siringa con 3 ml di soluzione filtrata di blu di metilene.
nota: Per evitare la pressione idrostatica e il successivo flusso di colorante, posizionare la punta dell'ago sopra la siringa riempita con soluzione di blu di metilene.
2. Dissezione di embrioni prenatali
- Pulire le forbici da dissezione e le pinze con etanolo al 70%.
- Per raccogliere embrioni perinatali a E18.5 o E19.5, sopprimere i topi gravidi utilizzando prima l'inalazione di CO2 e quindi eseguire la lussazione cervicale secondo le linee guida NIH.
nota: La femmina di topo incinta di solito partorisce a partire da E18.5, tuttavia, i reni più grandi sono più facili da manipolare. Pertanto, i reni a E19.5 più vicini alla nascita sono più facili da eseguire questa analisi. Tuttavia, i cuccioli con ostruzioni bilaterali del tratto urinario muoiono dopo la nascita. A seconda delle caratteristiche dei topi sperimentali, dovrebbe essere determinato empiricamente un giorno/ora di raccolta appropriato.
- Spruzzare etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale e quindi aprire la cavità addominale ventralmente utilizzando forbici da dissezione e pinze.
- Sollevare l'intero utero e separarlo dal corpo tagliandolo con le forbici da dissezione sulla punta delle corna uterine.
- Sciacquare l'intero utero con 1x PBS in una capsula di Petri.
- Tagliare l'utero segmentalmente con le forbici da dissezione e rimuovere la decidua placentare con una pinza da dissezione per esporre gli embrioni nei sacchi vitellino.
- Rimuovere prima il sacco vitellino e poi rimuovere la membrana amniotica con una pinza da dissezione per liberare gli embrioni perinatali.
- Decapitare un embrione con le forbici da dissezione. Asciugare il sangue in eccesso con garze sterili. Fissare l'embrione con la superficie ventrale rivolta verso l'alto su un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera digitale per l'imaging. Raccogli la sua coda per la genotipizzazione, se necessario.
nota: Eseguire le iniezioni di un embrione alla volta.
- Aprire con cautela la cavità addominale di un embrione con una pinza strappando la pelle. Quindi, rimuovere con cura gli organi e i tessuti in eccesso come fegato, stomaco e intestino con una pinza tagliandoli o estraendoli per esporre i reni, gli ureteri e la vescica che si trovano dorsalmente (Figura 1A). Assorbire il sangue in eccesso dall'embrione sezionato con garze sterili, se necessario.
nota: Il sangue in eccesso interferisce con l'identificazione della pelvi renale per l'iniezione del colorante.
3. Iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale e monitoraggio del flusso di colorante
- Rimuovere le bolle nell'ago e nel tubo espellendo la soluzione di blu di metilene dalla punta dell'ago mediante pressione idrostatica. Sollevare la siringa contenente la soluzione colorante sopra il livello della punta dell'ago per avviare il flusso, quindi abbassare la siringa per interrompere il flusso.
- Inserire l'ago nella pelvi renale vicino all'uretere prossimale, facendo attenzione a non disturbarlo una volta posizionato. Eseguire l'iniezione di colorante in un rene per determinarne l'ostruzione del tratto urinario.
nota: Eseguire l'iniezione di colorante in qualsiasi rene anormale, in primo luogo, seguendo lo stesso modo per determinare l'ostruzione del tratto urinario.
- Sollevare la siringa di circa 20 cm per fornire una pressione idrostatica e far fluire 15 μL-60 μL della soluzione colorante. La velocità di flusso sarà di circa 3 μL/s se la siringa viene sollevata a questa altezza sopra l'embrione.
- Monitorare il colore blu del colorante iniziando prima nella pelvi renale, poi nella lunghezza dell'uretere e infine nel lume della vescica.
nota: Ci vogliono circa 5 secondi per vedere un colore colorante debole emergere all'interno del lume della vescica se l'uretere è inserito correttamente nella vescica. Lasciare che il colorante si accumuli nel sito ostruito per circa 15 secondi se non appare alcun colore del colorante nel lume della vescica.
- Posizionare la siringa verso il basso per arrestare il flusso di colorante e rimuovere l'ago dal rene.
- Scattare immagini del rene, dell'uretere e della vescica tracciate con una soluzione colorante utilizzando la fotocamera e il programma di imaging collegati a uno stereomicroscopio.
- Registra l'idronefrosi del rene, dell'idrouretere e la posizione finale della soluzione colorante in un quaderno di laboratorio.
- Eseguire l'iniezione del rene controlaterale come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.5 e lasciare fluire il colorante per circa 20 s in totale.
nota: Il lume della vescica sarà riempito con una soluzione colorante, indicata da un forte colore blu, se l'uretere è inserito correttamente nel lume della vescica. Dopo la valutazione dell'ostruzione della giunzione del tratto urinario, gli ureteri e la vescica possono essere fissati per il sezionamento.
