Isolamento delle ovaie di topo neonatale: una procedura chirurgica per prelevare un paio di ovaie da un modello di topo neonatale

Abstract

Fonte: et al. Morgan, S. Cultura e co-coltura delle ovaie di topo e dei follicoli ovarici. J. Vis. Exp. (2015).

In questo video, descriviamo una procedura chirurgica per isolare le ovaie da un topo neonatale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Dissezione e coltura dell'ovaio neonatale

1. Inserire 1 mL di terreno di dissezione (sciogliere 3 mg/mL di BSA nel terreno Leibowitz L15 e filtrare sterilizzare attraverso un filtro poroso da 0,2 μm e 25 mm di diametro) in ciascuna capsula sterile di vetro per embrioni.
2. Abbattere i cuccioli di topo neonatale di età compresa tra il giorno 0 e il 5 dopo la nascita, abbattendoli per decapitazione.
3. Afferrare la pelle che copre la parete addominale usando un paio di pinze per dissezione fine e praticare una grande incisione nella pelle e nella parete del corpo. Aprire l'incisione in modo che l'intero addome sia esposto. La vescica è solitamente gonfia in questa fase e può essere perforata per facilitare la dissezione.
4. Sposta le budella usando una pinza da orologiaio. Segui le corna uterine dalla vescica fino al rene su ciascun lato. L'ovaio si trova appena sotto il rene nella parte superiore dell'utero e apparirà come una struttura simile a una nuvola sotto un microscopio da dissezione.
5. Afferra delicatamente l'ovaio con una pinza da orologiaio e usa le forbici per recidere il suo attacco all'utero. Trasferire la coppia di ovaie in piastre per embrioni contenenti terreno di dissezione preriscaldato.
6. Eseguire la dissezione fine delle ovaie al microscopio da dissezione su un tavolino riscaldato (37 °C). Usa gli aghi da insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso, comprese le tube di Falloppio, fino a quando non rimane solo l'ovaio.
7. Trasferire ogni ovaia nel pozzetto di una piastra di coltura utilizzando una pipetta di vetro curva finemente disegnata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Leibowitz L15	Invitrogen	11415049
αMEM	Invitrogen	22571020	Fornito come bicarbonato di sodio tamponato (2.200 mg/L)
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	Codice: A9418	Per mezzo di dissezione
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	A3311	Per terreno di coltura
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	Codice A2153	Per il rivestimento di pipette in vetro
FSH	Merck Serono	Gonale F	Spesso è necessario eseguire il test in batch. Preparare la soluzione madre di 1UI/10μL in αMEM e conservare a -20 °C
Filtri per siringhe (25 mm, 0,2 μm)	Greiner	Codice 16532K	Filtro in acetato di cellulosa per filtrare volumi maggiori (>5 mL) di terreno.
Provette sterili	Greiner	187261
Piastra a 24 pozzetti	Greiner	Codice 662160
Aghi per insulina	Forniture mediche BD	Codice 037-7606	0,33 mm (29 g) + 1 mL
Piatti in vetro per embrioni	VWR	720-0579	Sterilizzare, quindi riscaldare prima dell'uso
Pipette in vetro	Fisher Scientifico	10209381	Rivestimento BSA prima dell'uso
Aghi per agopuntura	Acumedic LTD	30 mm x 0,25 Tipo C
Soluzione di formalina, tamponata neutra, 10%	Sigma Aldrich	HT5014-120mL
Membrane nucleopori Whatman	Camlab	WN/110414	Utilizzare superficie lucida verso l'alto, policarbonato, diametro 13 mm, dimensione dei pori 8,0 μm