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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali
- Mantenere topi femmine adulte di età compresa tra 3 e 6 settimane in una stanza con temperatura e umidità controllate (con fasi di 12L:12D e alimentate ad libitum).
- Iniettare nei topi per via intraperitoneale 2,5 UI di gonadotropina sierica (PMSG) per stimolare la crescita follicolare imitando gli effetti dell'ormone follicolo-stimolante (FSH). Isolare le ovaie per la raccolta degli ovociti antrali 48 ore dopo. Eutanasia della femmina di topo precedentemente iniettata con PMSG, come da linee guida standard.
- Rimuovere rapidamente le ovaie dalla cavità corporea e metterle nella capsula di Petri contenente terreno M2 per il successivo isolamento degli ovociti (vedere paragrafo 3).
- Praticare un'incisione sulla pelle che copre la parete addominale seguita da un'incisione nel peritoneo utilizzando forbici sterili per dissezione. Aprire l'incisione per esporre l'addome, muovere le viscere da un lato utilizzando una pinzetta sterile e localizzare le tube uterine, formando una forma a V a partire dalla vescica.
- Osserva le ovaie situate sotto i reni. Tenere ogni tubo con una pinzetta sterile e praticare una piccola incisione sul fondo delle ovaie per rilasciarle. Trasferire entrambe le ovaie sul fondo di una capsula di Petri contenente un terreno pre-equilibrato.
2. Preparazione degli ormoni
- Diluire il PMSG (disponibile in diverse concentrazioni stock) con una soluzione salina isotonica sterile per ottenere una concentrazione di lavoro di 2,5 U.I. di ormone per 0,1 mL per un volume di iniezione appropriato.
nota: Le soluzioni ormonali devono essere aliquotate in provette da 0,5 mL e conservate a -20 °C fino al giorno dell'uso. Non conservare le aliquote diluite per più di tre mesi a -20 °C. Una volta scongelate, se vengono eseguite iniezioni seriali, conservare le aliquote di soluzioni ormonali a +4 °C e utilizzarle entro 4 giorni.
3. Isolamento degli ovociti antrali
Per un corretto isolamento degli ovociti:
- Equilibrare il terreno M2 (M2) al 5% di CO2 e 37 °C per almeno 1 ora prima di iniziare la procedura di isolamento degli ovociti. Preparare due piastre di Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 mL di M2 per la puntura ovarica e la seconda con piccole gocce (20 μL) di M2 ricoperte di olio minerale (~1,5 mL) per il trasferimento degli ovociti dopo l'isolamento dall'ovaio (vedere i passaggi 3.4-3.6). Conservare entrambe le piastre di Petri nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C fino al momento dell'uso.
- Utilizzare uno stereomicroscopio durante le procedure di isolamento degli ovociti.
- Preparare pipette di vetro a bocca sottile per raccogliere gli ovociti allungando le pipette di vetro Pasteur tenute orizzontalmente (tenendo le estremità della pipetta con entrambe le mani), su una fiamma verticale proveniente dal bruciatore Bunsen (Figura 1).
- Una volta che il bicchiere inizia a sciogliersi, togliete la pipetta dalla fiamma ed eseguite un rapido movimento di trazione per ottenere la pipetta desiderata. Tagliare con le unghie il vetro in eccesso vicino alla punta stretta della pipetta per regolare la lunghezza e il diametro del capillare interno. Assicurarsi che il capillare sottile abbia un diametro interno di ~100 μm, leggermente superiore al diametro dell'ovocita (~80 μm).
- Per la pipetta per bocca, collegare un'estremità del tubo di aspirazione alla pipetta estratta utilizzando una punta appropriata e posizionare l'altra estremità in bocca, fissandola con i denti.
- Raccogliere le ovaie utilizzando una pinzetta sterile e depositarle sul fondo di una capsula di Petri per colture cellulari (35 mm x 10 mm). Coprirli con 1 mL di M2 precedentemente equilibrato a 37 °C e 5% di CO2 (Figura 2).
- Perforare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie con un ago sterile per siringa da insulina per rilasciare gli ovociti antrali in M2 (Figura 3).
- Pipettare delicatamente gli ovociti con la bocca attraverso una pipetta Pasteur stretta per rimuovere le cellule follicolari e qualsiasi altro possibile detrito tissutale (Figura 4A) e poi depositarli sul fondo di piccole gocce (20 μL) di M2 ricoperte di olio minerale adatto alla coltura di embrioni (precedentemente preparato; Figura 4B).
nota: È importante rimuovere tutte le cellule del cumulo attaccate alla zona pellucida degli ovociti mediante pipettaggio continuo attraverso diverse gocce di M2. Eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile per evitare alterazioni del pH del substrato.
