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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Doppie iniezioni di resina
- preparazione
- Preparare la soluzione di resina. Per le iniezioni di resina a doppio sistema, preparare sia la resina gialla che quella verde come descritto nei passaggi 1.1.2-1.1.4.
- Preparare 1 mL di aliquote di resina diluita per topo.
- Resina gialla: Diluire la gomma siliconica gialla (alta radiopacità) con il diluente trasparente in una diluizione 3:1 per preparare la resina gialla per l'iniezione.
- Resina verde: Mescolare la gomma siliconica blu (radiopacità non rilevabile) con il diluente trasparente in una diluizione 1:1 per preparare la resina blu. Per generare la resina verde, mescolare la resina blu diluita con la resina gialla diluita in un rapporto di 1:1. Agitare accuratamente la resina verde fino a quando il colore non è omogeneo.
nota: La resina blu ha una radiopacità molto bassa che non è rilevabile con la microCT, che quindi richiede la diluizione con la resina gialla per creare due resine con radiopacità diverse.
cautela: La resina può contenere cromato di piombo, che è un agente cancerogeno. Produce gas velenosi nel fuoco. Maneggiare con cura e smaltire la resina come rifiuto pericoloso.
- Preparare due set di iniezione (set di iniezione #1 e set di iniezione #2) con il tubo come descritto nei passaggi 1.1.6-1.1.11.
nota: Per i topi adulti (>P30 (30° giorno postnatale) = P30 - 2 anni), utilizzare il set di iniezione #1 (tubo PE10 con diametro esterno di 0,6 mm) per l'iniezione del dotto biliare comune e il set di iniezione #2 (tubo PE50 con diametro esterno di 0,96 mm) per l'iniezione della vena porta. Per i giovani topi postnatali (fino a P30), preparare due set di iniezione #1, uno per il dotto biliare e uno per l'iniezione della vena porta (nessun set di iniezione #2 poiché la vena porta è troppo stretta per ospitare il tubo PE50).
- Per preparare il set di iniezione #1, tagliare 30 cm di tubo PE10 e allungare un'estremità del tubo a mano tirandola fino a quando non diventa il più sottile possibile (Figura 1A, B, diametro circa 0,15 mm, tubo PE10 non teso ha un diametro di 0,6 mm).
- Tagliare la punta del tubo PE10 allungato in diagonale per creare una punta smussata (Figura 1B).
- Collegare l'estremità non tesa del tubo PE10 a un ago da 30 G (Figura 1A, set di iniezione #1).
- Per preparare il set di iniezione #2, tagliare 30 cm di tubo PE50 e allungare un'estremità del tubo a mano tirandola fino a quando non diventa abbastanza sottile da adattarsi alla vena porta (Figura 1A, B, circa 0,7 mm, il tubo PE50 non teso ha un diametro di 0,96 mm).
- Tagliare la punta del tubo PE50 allungato in diagonale per creare una punta smussata (Figura 1B).
- Collegare l'estremità non allungata del tubo PE50 a un ago da 23 G (Figura 1A, set di iniezione #2).
nota: Ogni set di iniezione può essere utilizzato solo per un'iniezione poiché la resina si indurisce nella siringa e nel tubo. Regolare le dimensioni della punta allungata e smussata in base alle dimensioni del dotto biliare comune e della vena porta del topo, a seconda dell'età, del genotipo e del fenotipo. In caso di dubbi sulle dimensioni e sull'adattamento del tubo, inserire il tubo nel condotto o nel recipiente appropriato dopo l'incisione e prima che il tubo venga riempito di resina. Se il tubo è troppo largo per entrare nel condotto/recipiente, allungarlo ulteriormente.
- Anestetizzare l'animale mediante inalazione di isoflurano (primo 4% nella camera di induzione e ~2% utilizzando il cono nasale).
- Posizionare il mouse su un banco ventilato su un cuscinetto di dissezione mentre il mouse respira isoflurano attraverso il cono del naso. Verificare che l'animale sia incosciente con un metodo raccomandato dall'istituto/IRB, ad esempio pizzicando una delle zampe.
cautela: L'isoflurano può causare sonnolenza o vertigini in caso di inalazione e può causare danni al sistema cardiovascolare e al sistema nervoso centrale in caso di esposizione prolungata o ripetuta. Non inalarlo. Maneggiare la sostanza su una panca ventilata e in aree ben ventilate.
nota: È possibile utilizzare un altro metodo di anestesia, purché compatibile con la perfusione cardiaca.
- Una volta che l'animale è incosciente, spruzzare il lato ventrale con etanolo al 70% per evitare interferenze dal pelo.
- Usando le forbici per la pelle, taglia la pelle, la fascia e lo strato muscolare partendo dalla linea mediana della cavità addominale e taglia fino alla cavità toracica per esporre gli organi interni.
- Afferra il processo xifoideo con una pinza per sollevare lo sterno e taglia il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati per esporre il cuore e i polmoni.
- Rimuovere la gabbia toracica tagliando le nervature sui lati sinistro e destro della gabbia toracica con le forbici. Fai particolare attenzione a non danneggiare il fegato in quanto ciò provocherà la fuoriuscita della resina.
- Usando una pinza dritta, tira il cuore verso il fegato e taglia via l'atrio destro.
- Inserire un ago a farfalla (23 G), collegato a una pompa di perfusione peristaltica, nel ventricolo sinistro. Perfondere il topo per via transcardiaca con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) ed eparina (1 U/g di peso corporeo del topo). Perfondere per 3 minuti con una velocità di perfusione di 5 mL/min.
nota: Se il topo viene perfuso correttamente, gli organi interni diventeranno pallidi, in particolare il fegato. Se, invece, i polmoni stanno diventando bianchi, l'ago viene inserito nel ventricolo destro e deve essere riposizionato. Dopo la perfusione, il topo viene dissanguato e può essere rimosso dal cono del naso e dall'isoflurano.
- Spegnere la pompa dell'isoflurano.
2. Iniezione di resina - Colata di resina del sistema biliare
- Sposta il mouse verso il microscopio di dissezione, l'addome verso l'alto, la coda verso lo sperimentatore e allontana la testa dallo sperimentatore. I punti di riferimento anatomici di interesse sono raffigurati nella Figura 2A.
- Individuare la vena cava inferiore (Figura 2A) spostando l'intestino di lato. Utilizzare le forbici a molla per praticare una piccola incisione trasversale nella vena cava inferiore per consentire il rilascio della pressione vascolare epatica (Figura 2Bi).
- Esporre il dotto biliare comune e la vena porta come descritto nei passaggi 1.2.4- 1.2.6.
- Spostare l'intestino e il pancreas sul lato destro (dello sperimentatore) utilizzando un batuffolo di cotone bagnato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Capovolgere il lato ventrale del fegato verso il cuore utilizzando il batuffolo di cotone inumidito con PBS per esporre la superficie viscerale e la regione ilare.
- Localizzare il dotto biliare comune che va dalla regione ilare attraverso il pancreas e nell'intestino allo sfintere di Oddi (Figura 2Bii, dotto biliare comune delineato con la linea tratteggiata gialla, punte di freccia nere puntano allo sfintere di Oddi).
nota: Assicurati che il fegato sia umido durante tutta la procedura cospargendolo di PBS.
- Eliminare il tessuto circostante (area ~5 mm) dal dotto biliare comune utilizzando una pinza diritta. Posizionare il filo di sutura di seta (misura 4-0, 0,17 mm, 3-5 cm di lunghezza) sotto il dotto biliare comune (Figura 2Bii) e fare un nodo sciolto attorno al dotto biliare comune (Figura 2Biii).
nota: Scegli un'area per il nodo a metà strada tra la regione ilare e lo sfintere di Oddi e a una certa distanza dalla vena porta in modo che, dopo che la sutura è stata stretta attorno al dotto biliare comune, non interferisca con l'iniezione della vena porta.
- Tenere le forbici a molla piatte contro il dotto biliare comune per praticare un'incisione obliqua al dotto biliare comune nel punto in cui il dotto biliare comune entra nel pancreas e nell'intestino accanto allo sfintere di Oddi. (Figura 2Biv), la linea tratteggiata gialla delinea lo sfintere della regione di Oddi, enfatizzato da punte di freccia nere).
nota: Questo è un passaggio cruciale. Effettuare un taglio obliquo e non trasversale, e praticare un'incisione; Non recidere il dotto biliare. Il taglio dell'intero dotto biliare rende l'inserimento del tubo molto impegnativo.
- Poco prima dell'uso, mescolare 1 mL di resina gialla con 50 μL di agente indurente (riempiendo e svuotando la siringa da 1 mL) e riempire una siringa Luer da 1 mL con la miscela di resina-agente indurente.
- Collegare la siringa piena con il tubo (set #1). Premere lo stantuffo per riempire completamente il tubo. Assicurarsi che la miscela di resina/agente indurente goccioli dalla punta del tubo.
nota: Evitare e rimuovere le bolle nella siringa e nel tubo per ottenere i migliori risultati.
- Usando una pinza, raddrizzare l'area intorno all'incisione del dotto biliare comune e inserire il tubo nell'apertura del dotto biliare comune (Figura 2Bv), con il bordo più lungo della punta smussata verso il basso verso il lato dorsale del dotto biliare. Questo orientamento assicura che la resina possa uscire dall'apertura del tubo, che è rivolta verso l'alto, nel condotto (Figura 2Bv).
- Stringere il nodo del filo di seta per fissare il tubo all'interno del dotto biliare comune (Figura 2Bvi).
- Iniettare la resina nel dotto biliare comune. Osservare la cistifellea e i singoli lobi del fegato.
- Massaggia il fegato con un batuffolo di cotone inumidito con PBS per aiutare a distribuire equamente la resina. I rami terminali dei dotti biliari riempiti di resina (nei topi wild-type) sono debolmente visibili sulla superficie del fegato.
nota: Il tempo previsto per riempire il fegato è di 30-100 s.
- Interrompere l'iniezione della resina quando compaiono punti di resina sulla superficie del fegato (Figura 2Ci, punte di freccia blu) o quando si incontra resistenza.
nota: Lavora il più velocemente possibile poiché la resina inizia a indurirsi dopo aver aggiunto l'agente indurente per resina. Il tempo di lavorazione dall'aggiunta dell'agente indurente è di circa 15 minuti.
- Rimuovere il tubo estraendolo dal dotto biliare comune e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Tagliare le estremità libere della sutura di seta, in modo che non interferiscano con l'iniezione della vena porta.
- Smaltire il tubo contenente resina e la resina rimanente nei rifiuti pericolosi e l'ago nei rifiuti taglienti.
