$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Sezionamento del nodo seno-atriale (SAN)
- Preparare la soluzione completa eparinizzata di Tyrode per la dissezione SAN.
- Aggiungere 400 μL di eparina (1.000 USP/mL) a 40 mL di soluzione di Complete Tyrode e scaldare a bagnomaria a 37 °C.
- Iniettare nel topo per via intraperitoneale 200-300 μL di eparina (1000 USP/mL) e lasciare riposare l'animale per 10 minuti.
- Eutanasia del topo eparinizzato per overdose di isoflurano.
- Posizionare il topo in una piccola camera di vetro che contiene vapori di isoflurano generati aggiungendo 200-300 μL di isoflurano liquido a una carta da filtro all'interno di un tubo di plastica perforato.
NOTA: Poiché l'isoflurano può causare irritazione cutanea e può anche essere assorbito attraverso la pelle, il liquido non deve entrare in contatto diretto con il mouse. Pertanto, la salvietta imbevuta di isoflurano viene posta in un tubo perforato per la somministrazione.
- Verificare la morte per cessazione del movimento e dello sforzo respiratorio e per assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. La morte di solito richiede circa 1-2 minuti dopo il posizionamento nella camera.
nota: La morte è solitamente accompagnata dalla minzione.
- Posiziona il topo in posizione supina su una tavola di dissezione con le zampe distese e fissa le zampe alla tavola usando aghi per siringa lunghi 1 pollice e calibro 23. Quindi rimuovere il pelo in prossimità del fondo della gabbia toracica utilizzando le forbici chirurgiche e tagliando il pelo alle radici.
nota: Per una tavola di dissezione, è possibile utilizzare coperchi di raffreddamento in polistirene.
- Tenendo la pelle con un emostato, utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione trasversale nella pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica da circa l'arco costale sinistro all'arco costale destro (Figura 1A).
- Tagliare il peritoneo con le forbici chirurgiche e separare accuratamente il fegato dal diaframma, facendo attenzione a non intaccare il fegato, che causerà un sanguinamento eccessivo (Figura 1B). Incidere il diaframma lungo il torace per esporre la cavità toracica (Figura 1C-D).
- Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare le pareti laterali della gabbia toracica dai bordi delle arcate costali fino alle clavicole per esporre il cuore, facendo attenzione a non danneggiare il cuore (Figura 1D). Quindi utilizzare un ago da siringa calibro 23 per fissare la gabbia toracica sopra la spalla, tenendola in posizione e lontano dal campo chirurgico.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per gocciolare la soluzione eparinizzata di Complete Tyrode calda (37 °C) sul cuore per mantenerlo umido.
nota: Non lasciare che il cuore si secchi.
- Rimuovere i polmoni tenendoli con una pinza Graefe extra fine e recidendo la trachea con le forbici chirurgiche (Figura 1E).
- Tenere l'apice del cuore con una pinza Graefe extra fine e rimuoverlo tagliando l'aorta e le vene cave con le forbici chirurgiche. Trasferire il cuore in una capsula di Petri contenente elastomero siliconico polimerizzato (Figura 2A) e utilizzare una pipetta di trasferimento per bagnare il cuore con 2-3 mL di soluzione completa di Tyrode eparinizzata calda (37 °C).
nota: Fare attenzione a non danneggiare la delicata parete posteriore degli atri destri, che contiene la SAN, e le vene atriali destre collegate. Il bagno del cuore con la soluzione di Complete Tyrode impedisce al cuore di seccarsi, ma non immergere completamente il cuore nella soluzione in quanto comprometterebbe la visibilità durante la dissezione.
- Orientare il cuore con l'atrio destro alla destra dello sperimentatore e l'atrio sinistro alla sinistra dello sperimentatore.
nota: La dissezione del tessuto SAN deve essere eseguita rapidamente per prevenire lesioni correlate all'ischemia.
- Attacca l'apice del cuore al piatto con un perno di dissezione. Quindi, tenendo la vena cava inferiore con la pinza per laminectomia Dumont #2, inserire un ago da siringa da 22 G attraverso la vena cava inferiore e superiore per localizzare la loro posizione nell'atrio destro, che identifica anche la posizione approssimativa del SAN (situato nella zona di tessuto tra la vena cava inferiore e superiore (Figura 2B).
- Utilizzando piccoli perni di dissezione, fissare le appendici atriali sinistra e destra al piatto.
- Tenendo l'appendice atriale sinistra con il forcipe per laminectomia Dumont #2, inserire un perno di dissezione attraverso l'appendice atriale sinistra per tenerla in posizione.
- Tenendo l'appendice atriale destra con la pinza Dumont #55, inserire un perno di dissezione attraverso l'appendice atriale destra per tenerla in posizione.
nota: Lo stesso tipo di pinza può essere utilizzato per tenere le appendici atriali sinistra e destra, se lo si desidera.
- Rimuovere l'ago della siringa che attraversa le vene cave.
- Per rilasciare il sangue dal cuore, utilizzare le forbici Castroviejo per rimuovere l'apice del cuore (cioè la metà inferiore) praticando un'incisione trasversale attraverso i ventricoli (Figura 2C). Quindi, lavare il cuore aggiungendo una soluzione di Complete Tyrode calda (37 °C) eparinizzata con una pipetta di trasferimento.
- Usa le forbici Castroviejo per tagliare lungo il setto atrioventricolare mantenendo l'incisione più vicina al ventricolo rispetto agli atri. Continuare a tagliare lungo il setto atrioventricolare fino a quando gli atri non si separano dai ventricoli.
- Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l'atrio sinistro.
- Posizionare i perni di dissezione nella periferia dell'atrio destro per renderlo piatto (Figura 2D). Rimuovere il grasso, i vasi o i tessuti rimanenti dall'atrio utilizzando le forbici Castroviejo.
- Individuare la SAN nell'atrio destro, che in questo orientamento è approssimativamente delimitato dalla vena cava superiore (in alto), dalla vena cava inferiore (in basso) e dalle cristae terminalis (a sinistra) (Figura 2D).
NOTA: La crista terminalis appare come una cresta muscolare scura tra l'appendice atriale destra e la SAN. Spesso l'arteria SAN può anche essere vista scorrere attraverso la SAN (Figura 2D).
