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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei sistemi di infusione con pompa microosmotica
NOTA: Preparare la pompa, il tampone del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) e il farmaco [soluzione proteica Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL in aCSF)) in condizioni sterili utilizzando tamponi filtrati con filtri da 0,2 μm e condurre tutte le procedure sotto la cappa di coltura con i guanti. Le procedure chirurgiche vengono condotte come segue:
- Preparare le pompe microosmotiche un giorno prima dell'intervento: Riempire la pompa microosmotica cerebrale con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) con una siringa da 1 ml e un ago a testa smussata forniti insieme al kit. Immergere la pompa microosmotica in aCSF e posizionarla su uno shaker e agitare delicatamente per una notte.
ATTENZIONE: La pompa deve essere riempita con aCSF e devono essere evitate bolle d'aria all'interno della pompa (Figura 1A).
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, preparare la soluzione proteica ricombinante Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluita in aCSF) da utilizzare nell'esperimento. Rimuovere l'aCSF dalla pompa e riempire lentamente la pompa con la soluzione farmacologica fino a quando l'eccesso non fuoriesce.
NOTA: 15 mL di soluzione aCSF o Met-CCL5/RANTES sono sufficienti per 5-8 pompe.
ATTENZIONE: Ripetere la procedura per assicurarsi che la pompa sia completamente riempita con il farmaco senza bolle all'interno.
- Tagliare i tubi del catetere alla lunghezza desiderata e fissarli con l'ago per infusione cerebrale smussato nel kit per infusione cerebrale. Riempire il kit per infusione e i tubi con il farmaco.
- Infine, assemblare e collegare il kit per l'infusione cerebrale alla pompa microosmotica.
ATTENZIONE: Non devono formarsi bolle nel tubo o nella pompa (Figura 1A).
- Immergere l'intero set di fusione pompa-cervello osmotico in aCSF in una provetta sterilizzata da 50 ml per evitare che la pompa si secchi. Il set di fusione pompa-cervello osmotico è ora pronto per essere utilizzato per la chirurgia.
NOTA: I sistemi di pompe microosmotiche possono essere utilizzati per l'infusione di farmaci a lungo termine. Ciò garantisce una modalità sicura e conveniente di somministrazione del farmaco nel cervello del topo.
2. Chirurgia Ventricolare Intracerebrale – impianto della pompa micro osmotica
ATTENZIONE: Sterilizzare l'ambiente chirurgico con etanolo al 75% e assicurarsi che le persone coinvolte nello studio indossino guanti sterili e un camice da laboratorio pulito. Gli strumenti/strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave e asciugati prima dell'uso e successivamente sterilizzati con etanolo al 75% tra gli interventi chirurgici dei topi.
- Pesare il topo e anestetizzarlo utilizzando l'iniezione intraperitoneale (IP) con Ketamina/Xilazina (Ketamina 50 mg/kg, Xilazina 10 mg/kg).
ATTENZIONE: I topi di peso corporeo inferiore a 24 g non sono raccomandati per la chirurgia di impianto della pompa osmotica.
- Montare e fissare la testa del topo sull'apparato stereotassico (Figura 1B).
- Usa un paio di forbici chirurgiche e tenaglie per aprire la pelle esterna che copre il cranio. Usa lo iodio per pulire il cranio periferico.
- Separare lo strato più esterno della pelle dalla pelle sottocutanea con l'aiuto di un paio di pinze a testa smussata vicino alla regione del collo per l'impianto del set di fusione pompa-cervello osmotico (Figura 1C).
- Contrassegnare il punto di infusione con riferimento alla mappa cerebrale (Figura 1D) utilizzando l'apparato stereotassico. In questo esperimento, l'ago deve essere impiantato nella regione del 3° ventricolo (Bregma: 0,0 mm laterale, 1,3 mm posteriore, 5,7 mm ventrale).
- Praticare un foro utilizzando un trapano per chiodi attorno all'area contrassegnata sul cranio (Figura 1E).
ATTENZIONE: Fare attenzione a non rompere le meningi e i vasi sanguigni del topo, evitando così l'interruzione dei micro-vasi sanguigni nel cervello.
- Posizionare il set di fusione pompa-cervello microosmotico contenente aCSF (come controllo) o farmaco (soluzione proteica Met-CCL5/RANTES) sotto la pelle dietro la regione del collo e inserire l'ago per infusione cerebrale nel foro praticato per infondere il farmaco nel cervello del topo (Figura 1E). L'ago penetrerà nelle meningi ed entrerà nel ventricolo. Fissare l'ago in posizione sul cranio utilizzando un gel desensibilizzante superficiale (Figura 1F) e attendere 1-2 minuti fino a quando la colla non si asciuga. Quindi, tagliare la parte sporgente sopra l'ago (Figura 1G-H).
- Utilizzare una colla adesiva per tessuti per guarire la ferita dell'operazione sulla testa. Applicare 50 μl di colla sulla parte superiore della ferita, unire entrambi i lati della pelle e tenere premuto per 30 s per consentire alla pelle di sigillarsi (Figura 1I).
ATTENZIONE: Utilizzare un tampone alcolico al 100% per pulire la ferita dopo l'intervento chirurgico e 100 ul di penicillina con streptomicina per prevenire l'infezione. NOTA: La pelle del topo formerà tessuto cicatriziale e guarirà in pochi giorni dopo la somministrazione della colla chirurgica. Il vantaggio principale della colla è l'evitare punti chirurgici che possono causare irritazioni o infiammazioni della pelle.
- Mettere il topo in una gabbia pulita tenuta su una piastra calda (riscaldata fino a 37 °C) e attendere che il topo si riprenda dall'effetto anestetico.
ATTENZIONE: È fondamentale mantenere la temperatura corporea del topo per aumentare le possibilità di sopravvivenza dopo l'intervento chirurgico.
- Dopo un periodo di recupero di una settimana, i topi saranno pronti per ulteriori esperimenti, come il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e il test di tolleranza all'insulina (ITT).
