Prelievo di ovaie intatte dal topo: una procedura chirurgica per isolare l'ovaio completo dal modello murino

Abstract

Fonte: Mason, J. B. et al. Procedure di trapianto ovarico ortotopico per indagare l'influenza della durata della vita e della salute della senescenza ovarica nei topi femmine. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, descriviamo una procedura chirurgica per prelevare ovaie intatte da un modello murino.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trapianto di ovaie intatte a topi anziani

NOTA: Questo protocollo descrive la procedura utilizzata durante il trasferimento delle ovaie da un topo giovane (60 giorni di età) a una femmina post-riproduttiva (12 mesi di età) dello stesso ceppo consanguineo. La stessa procedura viene utilizzata per il trapianto ovarico tra due topi femmine.

1. Pesare e anestetizzare l'animale donatore mediante iniezione intraperitoneale (I.P., ago da 27 ga), ad esempio utilizzando un cocktail di ketamina, xilazina e acepromazina (65 mg/kg di ketamina, 13 mg/kg di xilazina, 2,0 mg/kg, acepromazina; dose da cocktail - 6,5 ml/kg). Rimetti l'animale nella gabbia domestica riscaldata fino a quando l'anestesia non ha fatto effetto.
2. Una volta anestetizzato, rimuovere l'animale dalla gabbia di casa e posizionarlo su tovaglioli di carta riscaldati. Usando un tagliacapelli (preferibilmente la lama #40), rimuovere i peli di qualche mm lateralmente alla linea mediana su ciascun lato, iniziando appena sotto le costole e muovendosi distale, preparando una "patch" tagliata di circa 2-3 cm quadrati su entrambi i lati del topo prono lasciando una striscia di peli di circa 1-2 cm che copre la linea mediana.
3. Strofinare leggermente le aree tagliate con etanolo al 70% e applicare la soluzione di betadine sul sito tagliato con un batuffolo di cotone.
4. Applicare il gel antibiotico per la protezione degli occhi e somministrare meloxicam (2,0 mg/kg) per via sottocutanea (S.C., ago da 27 ga) sulla parte laterale del collo dell'animale per alleviare il dolore postoperatorio.
5. Posizionare l'animale in posizione prona su un campo chirurgico sterile riscaldato e pulire l'area tagliata con una garza di cotone imbevuta di etanolo al 70% di 2 cm x 2 cm.
6. Praticare un'incisione paralombare di 1,0-1,5 cm e sezionare senza mezzi termini la pelle dalla fascia sottostante. Fai un'altra incisione attraverso la fascia. Sezionare senza mezzi termini lateralmente sotto questa fascia il più superficialmente possibile fino a raggiungere la cavità addominale
7. Posizionare un piccolo telo chirurgico sull'incisione (tagliato da una garza di 2 cm x 2 cm) e bagnare il telo con soluzione fisiologica sterile.
8. Usando una piccola pinza, localizzare il tessuto adiposo che circonda l'ovaio nella cavità addominale ed estrarre delicatamente il cuscinetto adiposo e l'ovaio e posizionarlo sul telo di garza bagnato. Il cuscinetto adiposo ovarico apparirà più "bianco" del tessuto adiposo circostante.
9. Posiziona un morsetto Bulldog da 1,5 pollici sul cuscinetto adiposo (facendo attenzione a non ostruire la borsa ovarica) per tenere il tratto in posizione durante la procedura.
10. Spostare il microscopio da dissezione in posizione e identificare chiaramente la borsa ovarica. Afferrare la borsa con due pinze da orologiaio e incidere la borsa ovarica di fronte all'ilo ovarico per esporre l'ovaio. Se l'area di accesso prevista della borsa è altamente vascolarizzata, applicare una goccia di epinefrina (1:100.000) con una siringa sulla superficie della borsa per ridurre il sanguinamento al momento della lacerazione.
11. Rimuovere delicatamente l'ovaio dalla borsa ovarica e asportare l'ovaio bloccando l'ilo ovarico con una pinza da orologiaio per prevenire il sanguinamento.
12. Posizionare l'ovaio della donatrice in un vetro da orologio riempito con soluzione fisiologica sterile a 4°C, coprire leggermente e mettere da parte fino al momento del trapianto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio da dissezione	Qualsiasi cannocchiale da dissezione con distanza di lavoro regolabile.
Ricircolo d'acqua calda e tampone appropriato per il vostro campo chirurgico/di recupero.	Stryker/Gaymar	TP700	I cuscinetti d'acqua circolanti producono campi operativi e di recupero a temperatura uniforme e costante.
Strumenti chirurgici-strumenti di dissezione per l'accesso al tratto riproduttivo			La scelta di strumenti chirurgici specifici è altamente specifica per il chirurgo
Materiale di sutura per borsa ovarica	Suture	2809G: 9-0 o 2810G: 10-0 ETHILON NERO 5" BV130-5 cono	La sutura 10-0 può essere difficile da individuare se lasciata cadere sul campo operatorio.
Spugna di gelatina assorbibile	Pfizer	Gelfoam- PFIZER 09-0315-08	Tagliare in piccoli pezzi (~2 mm) in condizioni sterili.
Graffe per la chiusura della pelle	Becton Dickinson	MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Unguento per gli occhi.	MWI Forniture veterinarie Co.		Unguento oftalmico sterile Puralube
Siringhe per anestesia, analgesia ed epinefrina	MWI Forniture Veterinarie Co	BD 305536	27g x 3/8in, smusso intradermico 1/2ml
Siringhe per soluzione fisiologica.	MWI Forniture Veterinarie Co	BD 309657.	Siringa da 3 ml, punta Luer-Lok, ago da 27 g
Tosatrici/lama	Andis	Tagliacapelli a lama staccabile senza fili Super AGR+ ™ e lama CeramicEdge® #40.	Qualsiasi tosatrice con una lama fine.
etanolo	Forniture chimiche universitarie		Diluire al 70% per l'uso.
Soluzione di betadina	MWI Forniture veterinarie Co.	Telefono 3233
2x2 garze	MWI Forniture veterinarie Co.	3073	autoclavato con impacchi chirurgici
Perle di vetro borosilicato	Sigma-Aldrich Co	Z273619	Autoclave in fiale di sintilazione
4-vinilcicloesene diepossido	Sigma-Aldrich Co.	Codice 94956