$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei topi e inserimento di un catetere nella vena giugulare
NOTA: Qui, maschi o femmine, sono stati utilizzati topi reporter mTmG di 5-7 settimane (B6.129(Cg) Gt(ROSA)26Sortm4(ACTBtdTomato,-EGFP)Luo10) incrociati con topi Pf4-cre, consentendo l'etichettatura a fluorescenza verde intenso nei megacariociti e nelle piastrine. Prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare la camera di riscaldamento del microscopio per alcune ore.
- Trasporta il mouse nella sala di imaging e procedi all'anestesia.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di ketamina (ketamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
nota: La somministrazione ripetuta di ketamina / xilazina viene utilizzata qui e funziona bene, ma richiede l'interruzione della registrazione per una reiniezione regolare. In alternativa, se è disponibile una macchina per anestesia, l'induzione dell'anestesia può essere eseguita con ketamina/xilazina e successivamente mantenuta sotto inalazione di gas (miscela di isoflurano, aria e ossigeno).
- Sostituire l'animale nella sua gabbia fino a raggiungere l'anestesia profonda. Posizionare il mouse su una piastra riscaldata riscaldata a 37 °C per tutte le manipolazioni successive.
nota: Mentre l'animale raggiunge l'anestesia profonda, accendi il microscopio e tutte le attrezzature e imposta i diversi parametri necessari per iniziare l'esperimento una volta terminato l'intervento chirurgico. Qui, la procedura dura solo 3 ore ed è terminale. Il topo viene soppresso dopo l'esperimento senza svegliarsi. Pertanto, la disinfezione con etanolo per la pelle e gli strumenti è sufficiente. Tuttavia, a seconda delle linee guida istituzionali, o se la procedura durerà più a lungo, dovrebbero essere utilizzati metodi di disinfezione più completi, come tre scrub alternati con betadine/povidone e alcol.
2. Installa un catetere nella vena giugulare.
NOTA: È importante evitare il più possibile la contaminazione microbica durante l'intervento chirurgico. Fare attenzione a disinfettare accuratamente la pelle con etanolo al 70% (EtOH) prima di procedere con l'intervento chirurgico. Usa sempre forbici e pinzette sterilizzate e sciacquale regolarmente al 70% di EtOH. Lavora in un luogo pulito e indossa una mascherina. Per l'iniezione endovenosa viene utilizzato un catetere "sopra l'ago" da 22 G, costituito da un ago all'interno di un tubo di plastica (vedere la Tabella dei materiali).
- Posiziona il topo sulla schiena e fissa le zampe anteriori con del nastro chirurgico per allungare la gola (Figura 1A). Disinfettare la gola con etanolo al 70%.
nota: Per comodità, la gola può essere rasata prima dell'intervento chirurgico. Se la procedura dura più a lungo, è necessario eseguire un'accurata rasatura per una corretta tecnica asettica.
- Praticare un'incisione di 0,7-1 cm sulla vena giugulare destra o sinistra utilizzando forbici sterili. Allungare il tessuto connettivo adiacente per esporre la vena giugulare esterna e la parte superiore del muscolo pettorale (Figura 1A).
- Riempire il catetere con soluzione fisiologica calda e sterile. Inserire il catetere nella vena dopo essere penetrato attraverso il muscolo pettorale (Figura 1B).
nota: Fare attenzione a evitare bolle d'aria all'interno del catetere. È importante inserire il catetere attraverso il muscolo per prevenire l'emorragia poiché il muscolo formerà un punto di compressione. Anche i topi con difetti dell'emostasi, come i topi Itgb3-/-, non sanguinano all'inserimento del catetere con questo approccio.
- Rimuovere delicatamente l'ago e, se necessario, spostare con cautela il catetere più in profondità nella vena. Collegare la siringa e stabilizzare il catetere aggiungendo una goccia di colla chirurgica (Tabella dei materiali).
nota: È possibile inserire un catetere all'interno della vena caudale, anche se richiede un po' di pratica perché la vena ha un calibro più piccolo. Ciò è particolarmente difficile quando si utilizzano topi con peli scuri, la cui vena caudale è appena visibile. A causa del suo calibro maggiore, il posizionamento del catetere all'interno della vena giugulare può consentire un'iniezione più affidabile di volumi maggiori o trattamenti ripetuti. Si prega di notare che la siringa viene riempita per la prima volta con soluzione fisiologica calda e non dimenticare di iniettare il volume morto prima di iniettare la soluzione farmacologica.
- Riportare con cautela il mouse in posizione prona (Figura 1C). Applicare il gel (Tabella dei materiali) sugli occhi per prevenire la secchezza.
