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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Chirurgia e installazione dell'anello cranico
NOTA: Il supporto completo per l'installazione del mouse comprende 4 pezzi, un blocco e una piastra, l'anello per tenere la testa del mouse e una vite per fissare l'anello al blocco (Figura 1A). Tutti gli elementi del supporto sono stati ricavati da i.materialise.com mediante stampa 3D. La piastra è realizzata in polimero di acrilonitrile butadiene stirene (ABS), il blocco e la vite in acciaio inossidabile e l'anello in acciaio inossidabile di alta qualità (acciaio inossidabile altamente dettagliato) (vedere la Figura 2 per le dimensioni e i materiali per i file di stampa 3D). Il blocco è fissato in modo permanente al supporto, avvitato o incollato. Una volta fissato l'anello sul cranio del topo, deve essere avvitato al supporto del blocco (Figura 1A).
- Inumidire i capelli sul cuoio capelluto con un tovagliolo di carta bagnato con etanolo al 70% per la disinfezione. Rimuovere tutti i peli sciolti con un tovagliolo di carta bagnato.
nota: Per comodità, il cuoio capelluto può essere rasato prima dell'intervento chirurgico.
- Incidere il cuoio capelluto formando una T sulla linea mediana fino a 1 cm e tra le orecchie per esporre il calvario utilizzando forbici e pinzette sterili.
nota: L'anello sarà posizionato in modo da sovrapporsi alle ossa frontali e parietali (Figura 1B).
- Usa una pinzetta sterile per esporre il cranio. Rimuovere con cautela il periostio con forbici e pinzette. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica per rimuovere tutto il periostio ed eventuali detriti o peli, che potrebbero alterare l'imaging.
nota: Per limitare le reazioni infiammatorie, fare molta attenzione a non danneggiare l'osso.
- Rimuovere eventuali tracce di sangue risciacquando con soluzione fisiologica e asciugare rapidamente l'osso con un batuffolo di cotone asciutto. Applicare il gel di colla sull'anello, posizionarlo sull'osso esposto e mantenerlo per alcuni secondi in modo che l'anello sia saldamente attaccato al cranio><.
nota: Nessuna colla deve entrare nel campo di osservazione in quanto potrebbe portare a un'autofluorescenza indesiderata.
- Inumidire leggermente il cranio con un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione fisiologica.
- Preparare la pasta dentale siliconica mescolando accuratamente i componenti blu e gialli 1:1. Applicare la pasta dentale su tutto l'anello per sigillare per evitare perdite durante l'imaging. Rimuovere con cautela la pasta dentale o la colla che potrebbe essere entrata nell'anello.
- Riempire l'anello con soluzione fisiologica e verificare la presenza di perdite.
nota: La soluzione salina funge da mezzo di immersione per l'obiettivo del microscopio. Il sanguinamento può essere più critico quando si utilizzano topi con difetti correlati all'emostasi. È essenziale evitare che il sangue entri nell'anello in quanto potrebbe offuscare ulteriori immagini.
- Posizionare il mouse sul supporto e avvitare l'anello sul portablocco (Figura 1C). Posizionare gli impacchi piegati sotto la testa dell'animale per sollevare la testa ed evitare il distacco dell'anello dal cranio.
nota: La testa è fissata direttamente in modo da impedire i movimenti dell'immagine dovuti alla respirazione.
- Posizionare il supporto e il gruppo mouse nella camera riscaldata del microscopio (Figura 1D).
NOTA: Fare attenzione a non rimuovere mai il catetere inserito.
