Imaging intravitale: un metodo per l'osservazione a livello cellulare del pancreas di topo attraverso una finestra di imaging stabilizzata

Abstract

Fonte: Park, I. e Kim, P. Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, descriviamo l'imaging intravitale di un pancreas di topo attraverso una finestra stabilizzata per la visualizzazione a lungo termine delle dinamiche cellulari.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Imaging intravitale

1. Accendere il microscopio intravitale, compresa la potenza del laser.
2. Accendere il termoforo e impostare la regolazione omeotermica a 37 °C.
   nota: In alternativa, utilizzare un termoforo passivo o una lampada con controllo frequente se non è presente una regolazione omeotermica.
3. Prendi un topo con finestra pancreatica pre-impiantata. Eseguire l'anestesia intramuscolare con una miscela di tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   nota: Si raccomanda l'uso di tiletamina/zolazepam al posto della ketamina a causa del suo effetto avverso dell'iperglicemia. L'anestesia ottimale dovrebbe essere selezionata ai fini degli esperimenti.
4. Inserire un catetere vascolare per l'iniezione.
   1. Applicare pressione sul lato prossimale della coda con l'indice e il terzo dito in alternativa all'applicazione del laccio emostatico. Riscalda la coda con una lampada, se necessario.
   2. Sterilizzare la vena caudale con uno spray all'etanolo al 70%.
   3. Inserire un catetere da 30 G nella vena caudale laterale. Il rigurgito di sangue sarà visualizzato nella provetta PE10.
   4. Applicare un nastro di seta sul catetere per stabilizzarlo.
   5. Iniettare destrano FITC/TMR o altre sonde fluorescenti (25 μg di anti-CD31 coniugato con Alexa 647), a seconda dei casi, in base alla combinazione di sonde fluorescenti.
      nota: Per le sonde di anticorpi coniugati fluorescenti, iniettare 2 ore prima della sessione di imaging.
5. Trasferire il mouse dalla piattaforma chirurgica al tavolino di imaging.
6. Inserire una sonda rettale per controllare automaticamente la temperatura corporea con il sistema di termoforo omeotermico.
7. Inserire la finestra di imaging pancreatico nel supporto della finestra preparato durante la configurazione della microscopia intravitale (Figura 1). Per un microscopio invertito, potrebbe non essere necessario un supporto per finestra.
8. Eseguire l'imaging intravitale.
   1. Per l'imaging del pancreas, iniziare con un obiettivo a basso ingrandimento (ad es. 4x) per scansionare l'intera vista del pancreas nella finestra di imaging pancreatico (campo visivo consigliato: 2500 x 2500 μm).
   2. Dopo aver determinato la regione di interesse, passare a una lente dell'obiettivo con ingrandimento maggiore (20x o 40x) per eseguire l'imaging a livello cellulare (campo visivo consigliato: 500 x 500 μm o 250 x 250 μm). In questo esperimento, la risoluzione laterale e assiale era rispettivamente di circa 0,5 μm e 3 μm.
   3. Esegui l'imaging z-stack o time-lapse per osservare la struttura 3D o le dinamiche a livello cellulare, come la migrazione cellulare.
      nota: Per l'imaging delle cellule fluorescenti che esprimono proteine di animali transgenici (MIP-GFP), 30 s di esposizione laser intermittente a 488 nm con potenza fino a 0,43 mW sono risultati tollerabili senza fotosbiancamento evidente o danni ai tessuti. Per l'imaging delle proteine fluorescenti marcate con Alexa 647, la potenza del laser a 640 nm fino a 0,17 mW è risultata tollerabile senza fotosbiancamento evidente o danni ai tessuti. L'esposizione prolungata al laser di eccitazione con una potenza superiore a questa impostazione può portare al fotosbiancamento o al danneggiamento dei tessuti a causa della fototossicità. Regola il guadagno e la potenza adeguati per visualizzare in modo appropriato la regione di interesse. L'impostazione dettagliata dei parametri nella microscopia intravitale deve essere individualizzata per ogni microscopia intravitale preparata nell'istituto.

Results

Figura 1: Fotografia dell'implementazione della finestra di imaging intravitale pancreatico.Una finestra di imaging intravitale pancreatico viene impiantata nel topo nella fase traslazionale XYZ e il supporto della camera di imaging collegato alla montatura inclinabile è collegato alla finestra di imaging pancreatico. Copyright 2020 Associazione coreana per il diabete da Diabetes Metab J. 2020 44:1:1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Esteri succinimidilici (esteri NHS)	Invitrogen	Codice: A20006	Sonda fluorescente per coniugato con anticorpo
Tubo in polietilene BD Intramedic	BD Bioscienze	427401	Catetere PE10 per collegamento con ago
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Copribicchieri circolare	Marienfeld	0111520	Vetro di copertura per finestra per imaging pancreatico
FITC Destrano 2MDa	Merck (ex Sigma Aldrich)	FD200S	Per l'identificazione del vaso
IMARIS 8.1	Piano bit	IMARIS	elaborazione di immagini
Microscopia intravitale	Tecnologia IVIM	IVM-C	Microscopia intravitale
MIP-GFP	Il laboratorio Jackson	006864	B6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Finestra di imaging pancreatico	Geumto Engineering	Ordine personalizzato	Finestra di imaging pancreatico - ordine personalizzato
Physiosuite	Kent Scientifico	PS-02	Regolatore di temperatura omeotermico
TMR destrano 65-85kDa	Merck (ex Sigma Aldrich)	T1162	Per l'identificazione del vaso
Supporto per finestra	Geumto Engineering	Ordine personalizzato	Portafinestra - ordine personalizzato
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Agente anestetico
Rompun	Bayer	Rompun	Agente anestetico