Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Perfusione anterograda del cuore del topo
NOTA: La pipetta di trasferimento in plastica utilizzata per succhiare il cuore deve essere morbida e non essere bruscamente affusolata verso la punta. Scegli un piccolo morsetto vascolare con dentellatura. Gli strumenti consigliati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
- Escissione del cuore del topo e clampaggio dell'aorta
nota: I topi adulti (>8 settimane di età) devono essere soppressi mediante un sovradosaggio di pentobarbital sodico (>300 mg/kg, iniezione intraperitoneale [i.p.]) con eparina (8000 unità/kg).
- Espellere rapidamente il cuore del topo succhiando.
- Aprire rapidamente la cavità toracica per esporre il cuore. Tagliare la pipetta di trasferimento in plastica, la cui punta ha all'incirca le stesse dimensioni o leggermente più piccola del cuore esposto (di solito in un sito a circa 1 cm dal segno di 0,5 ml verso la punta, ma dipende dalle dimensioni del cuore).
- Aspirare il cuore nella pipetta, sollevare la pipetta per creare spazio sufficiente per inserire le forbici e asportare il cuore con le forbici curve dal lato dorsale, evitando di danneggiare gli atri.
- Trasferire immediatamente il cuore asportato nel becher di vetro da 30 ml contenente CIB-EGTA ghiacciato per fermare la contrazione. Questa procedura richiede solitamente <1 min.
- Pulizia intorno all'aorta
- Trasferire il cuore in una piastra di coltura da 35 mm riempita con CIB-EGTA ghiacciato e rimuovere il polmone e gli altri tessuti visibili, quindi trasferire il cuore grossolanamente pulito nel supporto cardiaco riempito con CIB-EGTA raffreddato e posizionarlo con l'apice rivolto verso il basso.
- Sotto il microscopio stereoscopico, rimuovere il grasso e i tessuti connettivi per pulire intorno all'aorta. Se la lunghezza dell'aorta tagliata è troppo lunga, compresa l'arteria brachiocefalica, l'arteria carotide comune sinistra o l'arteria succlavia sinistra, tagliare l'aorta appena sotto l'arteria brachiocefalica per accorciarla e procedere alla fase successiva. Questa procedura richiede solitamente circa 4 minuti
- Bloccaggio dell'aorta e posizionamento del cuore bloccato sulla placca di perfusione
- Inserire l'ago per iniezione e iniziare la perfusione per scaricare il sangue
- Sotto il microscopio, posiziona il cuore nel supporto del cuore. L'operatore deve affrontare la superficie anteriore del cuore, raccogliere l'estremità dell'aorta con una pinzetta e bloccare l'aorta vicino agli atri con una piccola pinza vascolare mentre spinge delicatamente verso il basso l'aorta.
- Posizionare il cuore bloccato sulla piastra di perfusione con il lato anteriore rivolto verso l'alto, quindi coprirlo con alcune gocce di CIB-EGTA per evitare che si secchi. Questa procedura richiede solitamente <20 s.
- Perfusione anterograda del cuore
nota: Innanzitutto, perfondere il cuore con CIB-EGTA per scaricare il sangue e prevenire la coagulazione.
- Inserire l'ago per iniezione e iniziare la perfusione per scaricare il sangue
- Posizionare la siringa da 20 ml riempita con CIB-EGTA preriscaldato collegata al tubo di prolunga flessibile e a un ago per iniezione contrassegnato sulla pompa di infusione. Avviare la pompa a una velocità lenta di 0,5 ml/min per riempire accuratamente l'ago e la provetta con CIB-EGTA e assicurarsi di evitare che l'aria entri nella provetta.
- Posizionare l'ago per iniezione sulla piastra di perfusione con il lato più corto della forma diagonale davanti. Far scorrere l'ago verso l'apice del cuore fino a toccarlo, quindi inserire con cautela l'ago vicino all'apice del ventricolo sinistro nella camera ventricolare senza torcere. Non staccare l'ago dalla placca durante l'inserimento.
- Osservare il segno rosso per stimare la profondità di inserimento dell'ago. Quando l'inserimento dell'ago è completato, il sangue che scorre dall'arteria coronaria dovrebbe iniziare a essere scaricato.
- Fissare l'ago per iniezione sulla piastra con del nastro adesivo e aumentare la velocità della pompa a 1 ml/min. Questa procedura richiede solitamente circa 30 s. Se il cuore viene perfuso con successo, il flusso del CIB-EGTA nel capillare appena sotto l'epicardio può essere visto al microscopio.
