Fissazione della pressione della valvola polmonare murina isolata: una procedura per isolare e fissare chimicamente la valvola polmonare del topo in conformazione chiusa

Abstract

Fonte: Liu, Y., et al. Chirurgia ed elaborazione dei campioni per l'imaging correlativo della valvola polmonare murina. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, descriviamo la procedura per isolare e fissare chimicamente il valore polmonare del topo in conformazione chiusa tramite pressurizzazione per perfusione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Escissione della valvola polmonare

1. Autoclavare in autoclave gli strumenti necessari per la dissezione del topo. Ciò include forbici fini, micro pinze, micro pinze vascolari, pinze per l'applicazione di morsetti, portamicroaghi, forbici a molla e divaricatori.
2. Acclimatare tutti i topi per un minimo di 2 settimane prima dell'operazione. Rimuovere i topi C57BL/6, di circa 1 anno di età, dalle loro gabbie e pesare, quindi sopprimere con un cocktail di ketamina/xilazina (3:1 ketamina:xilazina, 0,01 ml per g) overdose.
3. Posiziona il mouse in posizione di decubito dorsale su un vassoio e fissa i suoi arti con del nastro adesivo. Una volta fissato, eseguire la toracotomia.
   1. Esporre il cuore rimuovendo il tessuto adiposo in eccesso e la fascia.
   2. Rimuovere l'atrio destro e perfondere attraverso il ventricolo sinistro con una soluzione salina a temperatura ambiente (NaCl allo 0,9%). La perfusione dovrebbe richiedere circa 20 mL in 30 s. Ciò si traduce nel dissanguamento del topo.
4. Rimuovere l'intero cuore recidendo la vena cava superiore, la vena cava inferiore, l'arteria polmonare e l'aorta. Particolare attenzione deve essere prestata all'arteria polmonare. Tagliare circa 2 mm sopra la giunzione ventricolo-arteriosa, in quanto questa servirà come condotto per la pressurizzazione.
5. Rimuovere i ventricoli sinistro e destro per esporre le camere alla pressione atmosferica. Assicurarsi che la struttura del tronco polmonare non venga influenzata dalla rimozione dei ventricoli.

2. Fissazione della pressione della valvola polmonare

1. Anastomosi tubo di pressurizzazione con arteria polmonare, lasciando una distanza di circa 1 mm tra la giunzione sino-tubulare e l'estremità del tubo per consentire ampi movimenti dei lembi e del tronco polmonare.
2. Elevare il serbatoio ad una pressione fisiologica analoga e riempirlo con la soluzione salina. Testare il sistema a flusso continuo per assicurarsi che non vi siano ostruzioni o bolle d'aria.
3. Collegare un rubinetto alla valvola polmonare anastomizzata e garantire un flusso adeguato attraverso il tubo (cioè senza bolle d'aria) commutando il tratto di deflusso. Una volta che il flusso è adeguato, commutare il deflusso verso la valvola polmonare anastomizzata e garantire la pressurizzazione del tronco polmonare. Questo è identificato dalla distensione del tronco polmonare.
4. Una volta confermata la pressurizzazione del tronco polmonare, incorporare gradualmente la soluzione fissativa primaria (1,25% glutaraldeide, 1,0% paraformaldeide in 0,15 M di cacodilato) fino a quando la soluzione salina non viene spurgata. Ciò avviene rimuovendo una porzione, circa il 25% della capacità del serbatoio, della soluzione salina e sostituendola con il fissativo primario.
   cautela: I fissativi utilizzati (paraformaldeide e glutaraldeide) sono altamente tossici e per garantire la sicurezza è necessario indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati.
5. Posizionare una garza imbevuta di fissativo sul campione di tessuto per evitare che si secchi.
6. Perfondere il fissativo per 3 ore, riempiendo il serbatoio secondo necessità per mantenere una pressione costante. Durante la fissazione, non è raro che la valvola polmonare si restringa a causa della fissazione chimica. In questo caso, riempire costantemente il serbatoio con il fissativo primario per mantenere la pressione fisiologica.
7. Conservare la valvola cardiaca nella soluzione fissativa a 4 °C fino al momento dell'uso. I campioni sono stati conservati per un massimo di 1 settimana senza alcuna differenza percepibile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
25% glutaraldeide (AQ)	Ems	Codice: 16210	Componente fissativo primario
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Siringa da 1 ml	Bd	309659
Siringa da 10 ml	Bd	309604
Ago da 22G	Bd	305156
Rubinetto a 3 vie	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4% paraformaldeide (AQ)	Ems	157-4-100	Componente fissativo primario
C57BL/6 mouse	Laboratori Jackson	664	Circa 1 anno
Pinza per l'applicazione del morsetto	FST	Codice 00072-14
Pinza Dumont #5	FST	Codice 11251-20
Pinze Dumont #5/45	FST	Codice 11251-35
Dumont #7 pinza fine	FST	Codice 11274-20
Forbice fine	FST	Codice 14028-10
Soluzione salina (sterile 0,9% cloruro di sodio)	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
Microscopio operatorio	Leica	M80
Porta aghi/pinza Tish	Mitrine	MI1540
taglierina	Wahl	9854-500
Sutura monofilamento in poliammide nero, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Sutura monofilamento in poliammide nero, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
Iniezione di ketamina cloridrato	Hospira Inc	NDC 0409-2053
Acido L-aspartico	Sigma-Aldrich	56-84-8	Componente colorante
Nitrato di piombo	Ems	Telefono 17900	Componente colorante
Cacodilato di sodio triidrato	Sigma-Aldrich	Codice 6131-99-3	buffer
Canzoni in tessuto non tessuto	McKesson Corp.	Codice 94442000
Pinza micro-adson	FST	Codice: 11018-12
Filtro Millex-GP, 0,22 um, PES 33mm, non sterile	EMD Millipore	SLGP033NS