Raccolta del deposito adiposo bianco e marrone dal cucciolo di topo: una procedura chirurgica per raccogliere il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno dal cucciolo di topo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Galmozzi, A. et al. Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari da topi neonati. J. Vis. Scadenza (2021)

In questo video, dimostriamo la procedura chirurgica per isolare il tessuto adiposo bianco sottocutaneo e il tessuto adiposo bruno interscapolare da un topo appena nato.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Raccolta e digestione dei depositi adiposi (giorno 1)

Preparare due provette da 1,5 ml per ogni cucciolo: una per il tessuto adiposo bruno (BAT) e una per il tessuto adiposo bianco (WAT). Aggiungere 250 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + 200 μL di tampone di isolamento 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl₂, 5 mM di glucosio, 100 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), penicillina-streptomicina e 4% di albumina sierica bovina priva di acidi grassi) a ciascuna provetta. Mantenere le soluzioni sterili e in ghiaccio.
Metti i cuccioli in piccole camere (ad esempio, un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e mettili in ghiaccio fino a quando non diventano ipotermici. Assicurati che non ci sia contatto diretto tra i cuccioli e il ghiaccio. Pungere una zampa con una punta per assicurare la perdita di coscienza e sopprimere i cuccioli mediante decapitazione con forbici affilate.
NOTA: se si lavora con genotipi diversi, preparare una provetta aggiuntiva per raccogliere una biopsia della coda (taglio di 3 mm) per la genotipizzazione. Se la genotipizzazione viene eseguita immediatamente, tenere i cuccioli soppressi sul ghiaccio fino alla dissezione per raccogliere i depositi adiposi.
Calcolare e pesare la quantità di collagenasi necessaria per digerire tutti i depositi. Aggiungere 50 μL di 15 mg/mL di collagenasi di tipo I in 2 tamponi di isolamento in ciascuna provetta. Non risospendere la collagenasi nel tampone di isolamento fino a quando tutti i tessuti non sono stati raccolti.
Per raccogliere il WAT sottocutaneo, tagliare la pelle intorno all'addome del cucciolo (evitare la rottura peritoneale) e tirare delicatamente la pelle verso il basso sotto le gambe. Senza prelevare la pelle, raccogliere con cura il deposito di grasso, che apparirà come un tessuto chiaro (P1 o più giovane) o bianco (P2 e più vecchio), sottile e allungato attaccato all'interno o sopra i quadricipiti (Figura 1A, B). Sciacquare il deposito di grasso in PBS e metterlo in una delle provette contenenti 250 μL di PBS + 200 μL di 2x tampone di isolamento. Mantenere il ghiaccio.
NOTA: I topi P0 e P1 offrono la migliore resa. Nei cuccioli di P0-1, il deposito sottocutaneo di WAT è quasi trasparente. Nei topi P2 e più anziani, il deposito è più facile da identificare perché sta già diventando bianco, indicando la presenza di adipociti bianchi completamente maturi, carichi di lipidi.
Per raccogliere il BAT interscapolare, tirare la pelle dalle scapole sopra la testa. Sollevare il BAT - il tessuto rosso intenso tra le scapole - e praticare con cura delle incisioni tutt'intorno ad esso per staccarlo dal corpo (Figura 1A, B). Verificare la consistenza e il colore; risciacquare con PBS; inserirlo nell'altra provetta contenente 250 μL di PBS + 200 μL di tampone di isolamento 2x; e mantieni il ghiaccio.
NOTA: Quando si raccoglie il BAT da topi P2 e più grandi, rimuovere con cura il tessuto adiposo bianco che circonda il BAT. È costituito da un foglio sottile, morbido e bianco di adipociti situato tra la pelle e il pipistrello, che è più profondo tra le scapole.

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Risultati

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Figura 1: Raccolta e lavorazione dei cuscinetti adiposi. (A) Rappresentazione schematica dell'isolamento primario degli adipociti bianchi (in alto) e marroni (in basso). (B) Depositi adiposi sottocutanei bianchi (in alto) e marroni (in basso). Nei topi P0, il WAT sottocutaneo è quasi invisibile, ma diventa distinguibile il ~giorno 2 dopo la nascita. Al contrario, BAT...