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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione del materiale e degli strumenti
- Collegare la coperta termica per mantenere la temperatura dell'area operativa e la temperatura del corpo del mouse durante l'anestesia a 37 °C.
- Forbici e pinze per autoclave, preparare una soluzione di etanolo al 70% e tenere a disposizione unguento per gli occhi al dexpantenolo, diversi pezzi di cotone e sutura in poliestere intrecciato rivestito 5-0 pronto per l'uso. Preparare una siringa da 1 ml con soluzione salina allo 0,9% (senza ago) per mantenere idratato il sito di incisione dell'animale. Preparare il gas di anestesia (100% O2 + isoflurano).
- Preparare un supporto per la sonda laser Doppler tagliando la punta di una punta per pipetta da 10 μL (lunghezza 3-5 mm).|
NOTA: Tutti gli strumenti vengono sterilizzati utilizzando uno sterilizzatore a microsfere calde. Le superfici vengono inoltre disinfettate prima e dopo l'intervento chirurgico con uno spray disinfettante microbico. Prima dell'intervento chirurgico, le aree che circondano la testa e il torace dei topi vengono disinfettate con uno spray disinfettante per la disinfezione delle ferite.
2. Preparazione del laser Doppler
- Iniettare analgesia nel topo 30 minuti prima dell'intervento chirurgico (4 mg/kg di carprofene e 0,1 mg/kg di buprenorfina, per via intraperitoneale).
- Anestetizzare il topo posizionandolo nella camera di induzione con una velocità di flusso di isoflurano del 4% fino alla cessazione del movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse.
- Posizionare il mouse in posizione prona nell'area operatoria con il naso nella maschera per anestesia. Mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per un altro minuto, quindi ridurla e mantenerla al 2%.
- Impostare il cuscinetto riscaldante controllato dal feedback associato per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C e inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche.
- Applicare l'unguento per gli occhi al dexpantenolo su entrambi gli occhi.
- Disinfettare la pelle e i peli che circondano l'occhio sinistro e l'orecchio con etanolo al 70%.
- Taglia il cuoio capelluto tra l'orecchio sinistro e l'occhio (lungo 1 cm) per esporre l'osso del cranio.
- Taglia e ritira il muscolo temporale per visualizzare l'MCA sotto il cranio.
- Fissare con la colla la parte esterna della punta tenendo la sonda/fibra laser Doppler sopra l'MCA sinistro con la colla. Quindi, incollare la pelle per chiudere la ferita attorno al supporto della punta. Applicare 2-3 gocce di colla indurente per accelerare il processo. Assicurarsi che la fibra laser Doppler non sia incollata e possa essere facilmente rimossa dal supporto della punta in qualsiasi momento.
3.Modello MCAo transitorio (occlusione)
- Ruota il mouse in posizione supina. Metti il muso nel cono dell'anestesia e fissa le zampe con del nastro adesivo.
- Disinfettare la pelle e i peli che circondano il torace e praticare un'incisione della linea mediana lunga 2 cm nel collo.
- Usa una pinza per separare la pelle e le ghiandole sottomandibolari. Utilizzare i divaricatori per trattenere il muscolo sternomastoideo, esporre il campo chirurgico e trovare l'arteria carotide comune sinistra (CCA). Sezionare il CCA libero dal tessuto connettivo e dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale) ed eseguire una legatura transitoria prima della biforcazione.
- Sezionare l'arteria carotide esterna (ECA) e fare un nodo permanente nella parte visibile più distale. Posizionare un'altra sutura sotto l'ECA, vicino alla biforcazione, e preparare un nodo sciolto da utilizzare in seguito.
- Sezionare l'arteria carotide interna (ICA) e posizionare una clip microvascolare su di essa, 5 mm sopra la biforcazione. Assicurati di non danneggiare il nervo vagale.
- Praticare un piccolo foro nell'ECA tra le legature strette e quelle allentate; fare attenzione a non tagliare l'intera ECA.
- Introdurre il filamento e farlo avanzare verso il CCA. Stringere la legatura libera nell'ECA attorno al lume per fissare brevemente il filamento in quella posizione ed evitare sanguinamenti durante la rimozione della clip microvascolare.
- Rimuovere la clip microvascolare e inserire il filamento attraverso l'ICA fino a raggiungere l'origine dell'MCA rilevando una forte riduzione (>80%) del flusso sanguigno cerebrale misurata dal laser Doppler. Fissare il filamento in questa posizione stringendo ulteriormente il nodo attorno all'ECA.
nota: Quando il filamento va nella direzione appropriata, avanza dolcemente e non si deve osservare alcuna resistenza.
- Registra i valori laser Doppler prima e dopo l'inserimento del filamento.
- Rimuovere il divaricatore e riposizionare il muscolo sternomastoideo e le ghiandole sottomandibolari prima di suturare la ferita. Rimuovere la sonda laser Doppler e posizionare l'animale in una camera di recupero a 37 °C per 1 ora (fino alla rimozione del filamento).