Modello di ansa ileale del topo: un modello chirurgico per studiare la permeabilità intestinale nel topo

Abstract

Fonte: Boerner, K., et al. Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale dei neutrofili nei topi utilizzando un modello standardizzato di ansa intestinale. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra la generazione di un modello di ansa ileale per studiare la permeabilità intestinale in un modello murino. Questo metodo fornisce un modello in tempo reale per comprendere la funzione della barriera epiteliale e la conseguente risposta immunitaria.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Generazione dell'anello ileale

1. Preparazione della pelle: Strofinare il pelo della linea mediana addominale con tamponi imbevuti di alcol o spugna di garza imbevuta di etanolo al 70%. Non bagnare un'ampia area di pelo con alcol per prevenire l'ipotermia.
2. Usando le forbici, eseguire una laparotomia della linea mediana. Praticare un'incisione verticale al centro dell'addome (circa 2 cm di lunghezza) ed esporre il peritoneo. Fare attenzione a non ferire gli organi intra-addominali.
3. Posizionare una garza di cotone bagnata pretagliata sulla cavità intra-addominale esposta.
4. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per mobilizzare ed esteriorizzare il cieco. Posizionare con cura il cieco sulla garza di cotone bagnata.
   nota: Il cieco è localizzato nel quadrante caudale sinistro della cavità addominale nella maggior parte dei topi, indipendentemente dal sesso dell'animale.
5. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per mobilizzare ed esteriorizzare delicatamente l'ileo di cui la sezione terminale (estremità distale) è attaccata al cieco (Figura 1B).
6. Distribuire almeno 6 cm di ileo terminale sulla garza di cotone bagnata senza interrompere i vasi mesenterici e l'afflusso di sangue. L'afflusso di sangue viene mantenuto se non c'è sanguinamento e il tessuto mantiene il suo colore rosa (Figura 1B).
   nota: Evitare l'essiccazione dei tessuti esposti mantenendo i tessuti sempre umidi con HBSS caldo (ogni 2 - 3 minuti) utilizzando una siringa da 10 ml precollegata a un tubo di alimentazione giallo.
7. Vicino al cieco, identificare l'arteria principale del mesentere, che fornisce sangue all'ileo. Quindi individuare due siti di legatura nel mesentere che sono privi di vasi sanguigni critici.
8. Usando una pinza per tessuti smussata, afferra saldamente l'ileo terminale (più vicino al cieco) e usando una pinza a punta sottile, fenestra il mesentere evitando i vasi sanguigni. Posizionare la sutura di seta attraverso la perforazione e fare un nodo chirurgico per creare la prima legatura (estremità distale dell'anello).
9. Usa il righello per misurare a 4 cm di distanza dalla prima legatura e crea la seconda legatura (estremità prossimale dell'anello) come menzionato nel passaggio 2.8 (Figura 1C).
10. Con forbici sottili tagliare accuratamente accanto a ciascuna legatura per isolare l'ansa ileale di 4 cm, mantenendo intatto l'afflusso di sangue e la membrana mesenterica.
    nota: Tagliare entrambe le estremità del segmento esteriorizzato dell'iLoop, quindi sciacquare delicatamente come passaggio necessario per prevenire l'interferenza con il contenuto luminale (materia fecale), facilitando così la dispersione uniforme di FITC-destrano o stimoli chemiotattici su tutta la lunghezza del segmento isolato, oltre a consentire una quantificazione più accurata dei leucociti mediante citometria a flusso. Questa procedura consente anche una distensione uniforme della mucosa dopo l'iniezione di volumi specificati di reagente e una migliore riproducibilità tra gli animali.
11. Sciacquare delicatamente il contenuto del segmento dell'ansa ileale con HBSS caldo utilizzando un tubo di alimentazione giallo flessibile collegato a una siringa da 10 mL.
12. Legare le due estremità tagliate dell'ansa ileale arrossata usando una sutura di seta.
13. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago da 30 G per iniettare lentamente 250 μl di reagente come FITC-destrano o chemochina nel lume intestinale. L'ansa ileale si gonfierà provocando una moderata distensione della mucosa (Figura 1D).
    nota: Iniettare il reagente nel lume dell'ansa sul lato opposto dell'arteria mesenterica. Fare attenzione a non estrarre l'ansa ileale dall'animale durante l'iniezione per evitare di strappare i vasi sanguigni e indurre sanguinamento.
14. Usando tamponi di cotone bagnati, rimetti delicatamente l'ansa ileale, l'ileo prossimale e il cieco.
15. Utilizzare un portaaghi, una pinza anatomica e suture di seta 3.0 non assorbibili con ago da taglio inverso per chiudere la parete addominale.
16. Posizionare l'animale in una camera di anestesia a temperatura regolata per il periodo di incubazione.

Results

Figura 1: Il modello dell'ansa ileale. (A) Panoramica schematica del modello dell'ansa ileale. La laparotomia mediana viene eseguita su topi sotto anestesia e posizionata su una tavola chirurgica a temperatura controllata. (B) Esteriorizzazione del cieco (*), dell'ileo e del mesentere. Sono stati identificati due siti adeguati per la legatura (1,2). (C) Isolare un segmento di 4 cm di lunghezza: la pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attrezzature e materiali
Tamponi imbevuti di alcol BD	Bd	326895
Ago BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	Bd	305122
Ago BD PrecisionGlide, 30G x 1/2"	Bd	305106
BD 1ml Siringa per tubercolina senza ago	Bd	309659
Provetta da centrifuga da 15 ml	Corning	14-959-53A
Micropiastra in polistirene nero solido a 96 pozzetti Corning	FisherScientific	07-200-592
Piatto di coltura non trattato Corning, 10 cm	MilliporeSigma	CLS430588
Applicatore con punta in cotone (batuffolo di cotone), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Spugne di garza riempite di cotone Dynarex, non sterili, 2" x 2"	Medex	Codice 3249-1
Vaporizzatore per anestesia EZ-7000 (sistema classico, comprese le unità di riscaldamento)	Sistemi E-Z	EZ-7000
Forbici fini Moria	FST	Codice: 14370-22
Puralube Vet Unguento, lubrificante oculare sterile	Dechra	12920060
Ring Forceps (pinza per tessuti smussati)	FST	Codice 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seta Intrecciata Nera, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Semken Forceps (pinza anatomica)	FST	Codice: 1108-13
Sofsilk non assorbibile rivestito sutura nera intrecciata seta taglia 3-0, 18", ago 19 mm lunghezza 3/8 cerchio taglio inverso	HenrySchein	Visualizzazione della stampa SS694
Pinza fine per studenti, angolata	FST	91110-10
Siringa da 10 ml PP/PE senza ago	Millipore Sigma	Z248029
Tubi di alimentazione gialli per roditori 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Soluzioni e buffer
La soluzione salina bilanciata di Hanks	Corning	21-023-CV
Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio	Corning	21-040-CV
Isoflurano	Alocarburo	Codice 12164-002-25