Generazione di un modello di ansa del colon prossimale di topo: una procedura chirurgica per generare un'ansa del colon prossimale e misurare la permeabilità intestinale rilevando marcatori fluorescenti nel siero dopo l'iniezione intraluminale

Abstract

Fonte: Boerner, K. et al. Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale dei neutrofili nei topi utilizzando un modello standardizzato di ansa intestinale. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, descriviamo una procedura chirurgica per generare un'ansa del colon prossimale di topo o un segmento pcLoop seguita da un'iniezione intraluminale di marcatori fluorescenti nel segmento per studiare la permeabilità epiteliale intestinale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Generazione dell'ansa del colon prossimale (pcLoop)

1. Preparazione della pelle: Strofinare il pelo della linea mediana addominale con tamponi imbevuti di alcol o spugna di garza imbevuta di etanolo al 70%. Non bagnare un'ampia area di pelo con alcol per prevenire l'ipotermia.
2. Usando le forbici, eseguire una laparotomia della linea mediana. Praticare un'incisione verticale al centro dell'addome (circa 2 cm di lunghezza) ed esporre il peritoneo. Fare attenzione a non ferire gli organi intra-addominali.
3. Posizionare una garza di cotone bagnata pretagliata sulla cavità intra-addominale esposta.
4. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per mobilizzare ed esteriorizzare il cieco. Posizionare con cura il cieco sulla garza di cotone bagnata.
   nota: Il cieco è localizzato nel quadrante caudale sinistro della cavità addominale nella maggior parte dei topi, indipendentemente dal sesso dell'animale.
5. Utilizzando tamponi di cotone bagnati, esteriorizzare l'intero ileo e posizionarlo sopra una garza di cotone bagnata. Identificare il colon prossimale e l'afflusso di sangue situati nel mesocolon. Mobilizzare il colon prossimale e, utilizzando una pinza a punta fine, creare la prima legatura in un'area priva di vasi nel mesocolon a circa 0,5 cm distale dal cieco (Figura 1B).
6. Misurare a 2 cm dalla prima legatura e creare una seconda legatura in un'area libera da afflusso di sangue nel mesocolon (Figura 1C).
7. Usando le forbici sottili, tagliate con cura accanto a ciascuna legatura per isolare un pcLoop.
   lungo 2 cm nota: Con le forbici sottili tagliate con cura accanto a ciascuna legatura per isolare l'ansa ileale di 4 cm, mantenendo intatto l'afflusso di sangue e la membrana mesenterica., è importante tagliare entrambe le estremità per isolare un pcLoop che viene delicatamente pulito dal contenuto luminale. Tagliare con cura il tessuto del colon e il mesocolon per evitare che piccoli vasi sanguinino nel lume intestinale. Se necessario, utilizzare il cauterizzazione termica per limitare il sanguinamento nel sito di incisione.
8. Sciacquare delicatamente il pcLoop con HBSS caldo per rimuovere le feci utilizzando un tubo di alimentazione giallo flessibile collegato a una siringa da 10 ml (preparare una siringa da 10 ml riempita con HBSS caldo e collegarla a un tubo di alimentazione giallo. Questa siringa verrà utilizzata per idratare i tessuti esposti durante l'intervento chirurgico).
9. Legare le due estremità tagliate del pcLoop lavato utilizzando una sutura di seta.
10. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago da 30 G per iniettare lentamente 200 μL di reagente come FITC-dextrans (1 mg/mL in HBSS). Conservare la soluzione di FITC-destrano non utilizzata al riparo dalla luce per preparare la curva standard dopo la raccolta del siero). Il pcLoop si gonfierà provocando una moderata distensione della mucosa (Figura 1D).
    nota: Iniettare il reagente nel lume pcLoop sul lato opposto dell'arteria mesenterica. Garantire la coerenza tra gli animali e creare un pcLoop lungo 2 cm per garantire un'equa distensione della mucosa.
11. Utilizza tamponi di cotone bagnati per riposizionare delicatamente il pcLoop, l'ileo e il cieco legati nella cavità addominale.
12. Utilizzare un portaaghi, una pinza anatomica e suture di seta 3.0 non assorbibili con ago da taglio inverso per chiudere la parete addominale.
13. Posizionare l'animale in una camera di anestesia a temperatura regolata per il periodo di incubazione.

Risultati

Figura 1: Il modello dell'ansa del colon prossimale. (A) Panoramica schematica del modello pcLoop. La laparotomia mediana viene eseguita su topi in anestesia posizionati su una tavola chirurgica a temperatura controllata. (B) Esteriorizzazione del cieco (*), del colon prossimale, del mesocolon e dell'ileo. Sono stati identificati due siti adeguati per la legatura (1,...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzature e materiale
Tamponi imbevuti di alcol BD	Bd	326895
BD 1ml Siringa per tubercolina senza ago	Bd	309659
Ago BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	Bd	305122
Ago BD PrecisionGlide, 30G x 1/2"	Bd	305106
Applicatore con punta in cotone (batuffolo di cotone), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Spugne di garza riempite di cotone Dynarex, non sterili, 2" x 2"	Medex	Codice 3249-1
Vaporizzatore per anestesia EZ-7000 (sistema classico, comprese le unità di riscaldamento)	Sistemi E-Z	EZ-7000
Kimwipes, piccoli (salviette per fazzoletti)	FisherScientific	06-666
Forbici fini Moria	FST	Codice: 14370-22
Puralube Vet Unguento, lubrificante oculare sterile	Dechra	12920060
Ring Forceps (pinza per tessuti smussati)	FST	Codice 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seta Intrecciata Nera, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Pinza Semken (anatomica pinze)	FST	Codice: 1108-13
Sofsilk non assorbibile rivestito sutura nera intrecciata seta taglia 3-0, 18", ago 19 mm lunghezza 3/8 cerchio taglio inverso	HenrySchein	Visualizzazione della stampa SS694
Pinza fine per studenti, angolata	FST	91110-10
Siringa da 10 ml PP/PE senza ago	Millipore Sigma	Z248029
Reagenti
Isoflurano	Alocarburo	Codice 12164-002-25
Fluoresceina Isotiocianato-Destrano, peso molecolare medio 4.000	sigma	Codice 60842-46-8