Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento muscolare EDL e digestione della collagenasi
- Spruzzare tutte le apparecchiature con etanolo al 70% per evitare contaminazioni.
- Sacrificare il topo in conformità con le normative nazionali per la sperimentazione animale.
- Spruzzare gli arti posteriori del topo con etanolo al 70%. Utilizzare forbici curve fini temprate (tagliente da 24 mm) e pinze fini (Dumont 7, curve o diritte) per rimuovere la pelle ed esporre i muscoli sottostanti. Evitare qualsiasi contatto dei muscoli sottostanti con il pelo (aumenta il rischio di contaminazione).
- Rimuovere la fascia circostante con una pinza curva fine senza danneggiare i muscoli sottostanti (Figura 1A). Chiudere la pinza per evitare che si pieghi.
- Usa una pinza curva per esporre i tendini distali del TA (tibiale anteriore) e del muscolo EDL. Per rimuovere il TA, afferrare il tendine TA distale con una pinza e tagliare con le forbici a molla sottili Vannas (tagliente 5 mm, diametro della punta 0,35 mm). Tenendo il TA al tendine, tirarlo verso il ginocchio e tagliare il muscolo vicino al ginocchio (Figura 1B), il muscolo EDL è ora esposto.
nota: Assicurati che in questo passaggio venga afferrato solo il tendine TA, altrimenti l'EDL sottostante potrebbe danneggiarsi. Quando si taglia il muscolo TA, assicurarsi che i tendini del ginocchio possano essere visti facilmente in seguito.
- Sollevare il tendine EDL distale con una pinza curva fine e tagliare con le forbici a molla Vannas sottili (Figura 1C). Esporre il tendine EDL prossimale tirando con cautela l'EDL verso il ginocchio. Tagliare il tendine prossimale con le forbici a molla sottili di Vannas. Trasferire il muscolo EDL nella soluzione di digestione della collagenasi preriscaldata a 37°C 2,5 mL, nella provetta di reazione da 15 mL. La soluzione di collagenasi viene preparata secondo questa procedura:
- Preparare la soluzione di digestione della collagenasi sciogliendo la collagenasi di tipo 1 allo 0,2% (p/v) (da Clostridium histolyticum) in DMEM (terreno di Eagle modificato di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. (Figura 1D).
nota: Praticare una piccola incisione sul tessuto connettivo esterno del ginocchio per esporre completamente il tendine EDL prossimale. Assicurati di afferrare solo i tendini e di non allungare troppo l'EDL.
- Ripetere i passaggi da 1.3. a 1.6 con il secondo EDL. Aggiungere entrambi i muscoli EDL alla stessa provetta di reazione da 15 mL riempita con 2,5 mL di soluzione digestiva di collagenasi.
- Incubare i muscoli EDL nella provetta di reazione a 37°C in un bagno d'acqua circolante.
nota: Il tempo di incubazione dipende da diversi fattori, come l'attività della collagenasi, l'età del topo e la quantità di tessuto fibrotico. Il tempo di incubazione tipico per i muscoli EDL dei topi adulti (2-6 mesi di età) è di 1-1,5 ore e per i topi anziani (18 mesi di età) di 1,5-2 ore.
- Per evitare un'eccessiva digestione dei muscoli, controllare i muscoli durante il tempo di digestione. Interrompere la digestione quando i muscoli si allentano e sono visibili singole miofibre (Figura 1E). Trasferire con cautela i muscoli con la pipetta a foro grande nel primo pozzetto della piastra preriscaldata a 12 pozzetti contenente il mezzo di isolamento della miofibra (Figura 1G), che viene preparata come segue:
- Integrare DMEM (terreno di Eagle's modificato di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio) con il 20% di FBS (siero fetale bovino), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Aggiungere il terreno alle piastre isolanti pre-rivestite (piastra a 12 pozzetti, 2-4 mL di terreno isolante per pozzetto) circa 30 minuti prima dell'isolamento ed equilibrare in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
2. Dissociazione delle miofibre
- Per i passaggi successivi utilizzare un microscopio stereobinoculare, preferibilmente dotato di una piastra riscaldante (37 °C). Utilizzare la pipetta a foro largo per lavare i muscoli con un mezzo isolante caldo fino a quando non vengono rilasciate singole miofibre. Dissociare i muscoli con la pipetta a foro largo fino a quando il numero desiderato di miofibre galleggia liberamente nella soluzione.
nota: Evitare un'eccessiva triturazione per ridurre il rischio di danneggiare le miofibre. L'uso di una piastra riscaldante per la dissociazione della miofibra è fortemente consigliato poiché la temperatura scende durante il processo di isolamento, provocando la morte della miofibra.
