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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Aghi di vetro sterili
- Accendere l'estrattore per pipette ad ago.
- Regolare la manopola del riscaldatore fino a quando il display non mostra 12.6.
- Aprire lo sportello e far passare manualmente il tubo capillare da 5 μl attraverso il morsetto superiore e il filamento del riscaldatore fino a quando metà del tubo non si estende al di sotto del filamento (Figura 1A).
- Verificare che il tubo capillare si trovi nella scanalatura a "V" del morsetto superiore. Stringere il morsetto superiore.
- Con il morsetto inferiore aperto, regolare manualmente la slitta verticale verso l'alto fino a quando il morsetto inferiore raggiunge il suo limite superiore. Verificare che il tubo si trovi nella scanalatura a "V" nella parte inferiore clamp. Stringere il morsetto inferiore.
- Chiudere lo sportello e verificare che la spia "Pronto" sia accesa. Premere il pulsante di avvio per avviare il riscaldatore e la sequenza di trazione (Figura 1B).
- Assicurarsi che il riscaldatore si spenga automaticamente dopo che il calore e la gravità hanno separato il tubo capillare (Figura 1C) e lo scorrimento si è spostato verso il basso.
- Apri la porta. Tenendo la parte superiore del tubo capillare, svitare il morsetto superiore. Rimuovere il tubo capillare superiore e metterlo da parte.
- Tenere il tubo capillare nella slitta inferiore e svitare il morsetto inferiore. Rimuovere il tubo capillare inferiore e metterlo da parte.
- Utilizzare una smussatrice per microelettrodi con una piastra abrasiva di allumina da 0,05 μm per smussare il tubo capillare tirato per creare gli aghi di iniezione.
- Pipettare sulla piastra di macinazione una quantità di acqua sufficiente a coprire la superficie (Figura 1D).
- Accendere la smussatrice in modo che inizi a ruotare a 60 giri/min. Posizionare il tubo capillare estratto nella pinza della pipetta nella scanalatura a "V". Serrare il morsetto e regolare l'angolo del morsetto della pipetta a 30°.
- Regolare la punta del bordo appuntito del tubo capillare a circa due terzi di distanza dal centro di rotazione della piastra di macinazione.
- Abbassare il tubo capillare bloccato regolando la manopola di controllo grossolana nella parte superiore del manipolatore. Continuare ad abbassare il tubo capillare fino a quando la punta del tubo capillare non si estende sotto la superficie dell'acqua e tocca la superficie abrasiva della piastra abrasiva.
- Monitorare l'avanzamento della smussatura utilizzando il microscopio collegato alla smussatrice . Dopo 5 minuti, regolare il controllo di precisione per sollevare l'ago del vetro dalla piastra di macinazione.
- Rimuovere l'ago di vetro e posizionarlo sotto un ingrandimento di 10x per controllare la punta del tubo capillare (Figura 1E, F).
- Per assicurarsi che non vi siano ostruzioni, inserire l'ago di vetro in un portapipette di una siringa e spingere l'aria in una provetta da 1 ml di etanolo al 99%. Se si formano bolle d'aria sulla punta dell'ago, l'ago non presenta ostruzioni e può essere utilizzato per la microiniezione. Questo processo garantisce anche la sterilità degli aghi di vetro.
- Un tubo capillare può contenere fino a 5 μl di liquido. Contrassegnare il tubo capillare in 10 sezioni per calcolare le distanze sull'ago da marcare per volumi di 0,5 μl. Segnare una scala con quella distanza che contenga 0,5 μl per la preparazione futura. Per un ago da 5 μl, distanze di 0,7 mm equivalgono a 0,5 μl (Figura 1G).
2. Iniezione intravitreale nel topo
- Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di Biosicurezza di Livello 2.
- Preparare il sito della procedura posizionando i sottocuscinetti medici sul tavolo operatorio.
- Accendere il microiniettore e aprire la valvola del gas sul serbatoio dell'aria compressa collegato al microiniettore. Regolare il regolatore del serbatoio fino a quando l'erogazione del gas è di circa 60 psi.
- Sul microiniettore, premere Mode finché lo schermo non mostra Balance. Premere Balance e posizionare il mouse del computer sul tavolo operatorio. Collegare il portapipetta in acciaio inossidabile al tubo collegato a "Riempimento/Uscita" dell'iniettore. Questo tubo è sempre collegato all'iniettore.
- Inserire l'ago capillare all'altra estremità del portapipette avvitando saldamente il connettore del portapipetta attorno all'ago.
- Accendi il microscopio oftalmico e accendi la sua luce a un'intensità del 50%. Regolare il microscopio sul sito della procedura sul tavolo operatorio e regolare il microscopio sulla messa a fuoco desiderata.
- Prima dell'inizio della procedura, verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato testando il riflesso di ritiro del pedale. Assicurati di seguire il protocollo approvato IACUC per l'anestesia.
- Posizionare il mouse anestetizzato sulle imbottiture mediche con il naso rivolto a destra e appoggiato sul lato sinistro.
- Guarda l'occhio destro del topo attraverso il microscopio oftalmico e apri le palpebre aprendo le pinze di una pinza ad azione inversa su entrambi i lati dell'occhio per esporre il sito di iniezione (Figura 2C).
- Riempire l'ago capillare con la soluzione batterica di Bacillus cereus (ATCC 14579) (diluizione 200 CFU/μL) facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul tappetino del mouse collegato al microiniettore (Figura 2D).
- Fissa la testa dell'animale con la mano sinistra e posiziona la punta dell'ago sul limbus dell'occhio. Con l'ago in posizione smussata verso l'alto e con un angolo di 45°, forare la cruna del mouse, ma assicurarsi che durante l'iniezione venga inserita solo la punta affilata dell'ago (~0,5 mm).
- Una volta inserita la punta dell'ago, spostare la mano sinistra dalla testa del mouse al tappetino del mouse e fare clic con il pulsante destro del mouse sul tappetino del mouse per iniettare 0,5 μL della diluizione di B. cereus preparata nel brodo Brain Heart Infusion (BHI). Per evitare perdite, lasciare la punta dell'ago all'interno della cruna del mouse per 2-3 secondi prima di rimuoverla (Figura 2E).
- Rilascia la pinza e posiziona il mouse in una gabbia appoggiata su un cuscinetto riscaldante. Monitorare questi topi fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia (Figura 2F).
- Una volta che i topi si sono ripresi dall'anestesia, rimettere la gabbia nella sua rastrelliera corretta. Se i topi saranno sottoposti ad analisi della funzionalità retinica mediante elettroretinografia, le gabbie devono essere riportate in una stanza buia per un corretto adattamento al buio.
