Saggio di quantificazione dell'infezione batterica: un metodo per quantificare la carica batterica intraoculare in un modello murino di endoftalmite batterica

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del tubo di raccolta

1. Inserire perle di vetro sterili da 1 mm in provette con tappo a vite da 1,5 mL.
2. Sterilizzare queste provette in autoclave a secco. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente prima dell'uso.
3. Aggiungere 10 mL di 1x soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a una provetta da centrifuga sterile da 15 mL.
4. Aggiungere 1 compressa di cocktail di inibitori della proteasi nel tubo. Mescolare a vortice.
5. Pipettare 400 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente inibitore della proteasi in ciascuna provetta di raccolta autoclavata. Etichettare i tubi e metterli sul ghiaccio. (Figura 1A).

2. Raccogliere gli occhi

1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di Biosicurezza di Livello 2.
2. Eutanasia del topo per inalazione di CO₂. Usa un metodo secondario per confermare l'eutanasia.
3. Tenere saldamente la testa del topo soppressa e aprire le pinze a punta sottile su entrambi i lati dell'occhio infetto. Spingere verso il basso verso la testa per sostenere l'occhio. Una volta che le pinze sono dietro il globo dell'occhio, stringile insieme. Tirare le pinze lontano dalla testa per staccare il bulbo oculare (Figura 1B).
4. Posizionare immediatamente il bulbo oculare in un tubo di raccolta etichettato. Mettere le provette sul ghiaccio per non più di 60 minuti (Figura 1C).

3. Conta batterica intraoculare

1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di Biosicurezza di Livello 2.
2. Verificare che tutte le provette di prelievo siano ben chiuse e bilanciate mentre si trovano nell'omogeneizzatore tissutale (Figura 2A). Accendere l'omogeneizzatore tissutale per 1 minuto per omogeneizzare i campioni. Attendere 30 secondi, quindi accendere per un altro minuto. Posizionare i tubi sul ghiaccio (Figura 2B, C).
3. Diluire in serie ogni campione di 10 volte trasferendo in sequenza 20 μl di omogenato in 180 μl di 1x PBS sterile. Diluire fino a raggiungere un fattore di ^10-7 (Figura 2D).
4. Etichettare ogni riga di una piastra BHI quadrata calda con i fattori di diluizione appropriati. Trasferire 10 μl di ciascuna diluizione di seguito sulla piastra BHI superiore inclinata di circa 45°. Lasciare scorrere il campione fino a raggiungere quasi il fondo della piastra, quindi adagiare la piastra in piano (Figura 2E).
5. Quando il campione viene assorbito nell'agar BHI, trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C. Le colonie dovrebbero iniziare ad essere visibili 8 ore dopo essere state messe nell'incubatrice.
6. Rimuovere la piastra dall'incubatrice prima che la crescita delle colonie di B. cereus interferisca con l'identificazione delle singole colonie (Figura 2F).
7. Per una rappresentazione accurata della concentrazione nel campione, contare la fila che ha tra 10-100 colonie. Ad esempio, una fila con la frazione di diluizione di ^10-4 che ha 45 colonie avrà una concentrazione di 4,5 x 10⁵ CFU/mL.
8. Per calcolare il numero totale di batteri per occhio, moltiplicare la concentrazione per 0,4, che rappresenta il volume in millilitri di 1x PBS utilizzato per omogeneizzare l'occhio. Ad esempio, la concentrazione di 4,5 x 10⁵ CFU/mL si tradurrebbe in 1,8 x 10⁵ CFU di B. cereus per occhio.

Figura 1: Raccolta dell'occhio infetto del topo. Dopo l'infezione, dopo il punto temporale desiderato, prelevare gli occhi del topo infetto utilizzando una pinzetta sterile. (A) PBS contenente perle di vetro sterili. (B) Prelievo dell'occhio infetto. (C) Tubo di raccolta contenente un occhio di topo.

Figura 2: Elaborazione dell'occhio prelevato per la conta batterica intraoculare. (A) Provetta di prelievo con l'occhio infetto serrato saldamente a un omogeneizzatore tissutale. (B) Gli occhi infetti sono stati omogeneizzati due volte per 1 minuto ciascuno. Tracciare la diluizione (D) degli omogeneizzati oculari (C) e la successiva placcatura (E) per la quantificazione batterica. (E) Colonia individuale rappresentativa di Bacillus cereus dopo diluizione della pista.