Prelievo di blocchi cardiopolmonari da coniglio: una procedura chirurgica per recuperare il blocco cuore-polmone funzionale dal modello di coniglio

Abstract

Fonte: Pacheco-Baltazar, A., et al. Sistema di perfusione polmonare isolato nel modello del coniglio. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, mostriamo una procedura per prelevare chirurgicamente un blocco cardiopolmonare funzionale da un modello di coniglio. Il blocco raccolto può essere utilizzato per ulteriori studi fisiologici, farmacologici o biochimici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Attrezzatura e preparazione dell'apparato.

1. Disposizione dell'attrezzatura:
   1. Imposta un tavolo operatorio con dimensioni in base al peso del coniglio.
   2. Montare il coperchio del torace artificiale sulla colonna d'acciaio con la camera di vetro sottostante e il ventilatore con una pompa a rulli ai lati.
   3. Assicurarsi che la copertura sia facilmente inclinabile per avere la cannula tracheale in linea con la trachea per consentire una connessione più rapida.
2. Torace artificiale:
   NOTA: È una parte essenziale del sistema. È costituito da una camera di vetro rivestita d'acqua sigillata da un coperchio speciale. Il coperchio funge da supporto per l'organo con le connessioni per incannulare la trachea e i vasi incorporati in essa.
   1. Impostare un getto Venturi azionato da aria compressa per generare la pressione negativa all'interno del torace artificiale.
      nota: Il modulo di controllo della ventilazione (VCM) consente di regolare separatamente la pressione inspiratoria e quella di fine espirazione, nonché la frequenza respiratoria e il rapporto tra la durata inspiratoria e la durata totale del ciclo.
3. apparecchio:
   1. Assicurarsi che un apparecchio normalmente funzionante sia costituito da una colonna principale in acciaio montata su una piastra di base che sostiene il torace artificiale, con lo pneumotacometro e il trasduttore di peso situati sopra di essa e dietro la bobina di preriscaldamento con una trappola per bolle.
   2. Collegare un trasduttore di pressione differenziale allo pneumotacometro e un altro alla pressione della camera. Posizionare una coppia diversa di trasduttori di pressione dietro il torace per misurare la perfusione e le pressioni venose.
   3. Collegare il calcio di commutazione sotto l'ossigenatore con un elettrodo di livello e il sistema di ventilazione accanto all'apparato.

2. Estrazione chirurgica del blocco cardiopolmonare.

1. anestesia:
   1. Utilizzare una combinazione di un sedativo (xilazina) e un barbiturico (pentobarbital).
      nota: Diversi cocktail anestetici possono essere utilizzati senza alcun effetto sui risultati sperimentali.
   2. In primo luogo, sedare i conigli neozelandesi sani con una singola iniezione intramuscolare di xilazina cloridrato (3-5 mg/kg). Assicurarsi che i conigli rimangano calmi e rilassati per consentire ulteriori manipolazioni dopo alcuni minuti dall'iniezione.
   3. Dopo la sedazione, utilizzare le vene marginali (laterali) dell'orecchio come accesso per anestetizzare i conigli con un'iniezione endovenosa di pentobarbital sodico (28 mg/kg).
2. monitoraggio:
   1. Per evitare un'anestesia insufficiente o un'eccessiva depressione delle funzioni cardiache e respiratorie, monitorare i seguenti parametri. Per valutare la profondità dell'anestesia, eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
   2. Assicurati che la mucosa sia rosa. Le tonalità blu o grigie indicano ipossia.
   3. Assicurarsi che la frequenza cardiaca sia compresa tra 120 e 135 battiti/min e che la temperatura corporea non scenda sotto i 36.5 °C.
3. Posizionamento degli animali:
   1. Radere il busto del coniglio e posizionare l'animale sul tavolo operatorio in posizione supina. Posizionare il sistema di ventilazione vicino al tavolo, dietro la testa del coniglio, per consentire il collegamento rapido delle cannule dopo la tracheotomia per evitare danni tissutali.
4. Incisione e tracheotomia:
   1. Sezionare la pelle con un'incisione della linea mediana ventrale di 3-5 cm dal diaframma fino al collo.
   2. Con le forbici operatorie, tagliare i 2/3 anteriori della trachea tra due anelli di cartilagine per inserire la cannula tracheale attraverso la membrana fibrosa tracheale.
   3. Inserire un 5 mm (diametro esterno; OD) attraverso la membrana fibrosa tracheale e utilizzare una sutura di seta 4-0 per fissarla con cura.
   4. Posiziona una pinza o una pinzetta sotto la trachea per assicurarti che la cannula non si pieghi contro la trachea.
5. Ventilazione a pressione positiva:
   1. Finché i polmoni rimangono al di fuori del torace artificiale, utilizzare una pompa respiratoria di piccole dimensioni per ventilare una pressione positiva al fine di evitare il collasso polmonare durante l'intervento chirurgico.
   2. Avviare la ventilazione attraverso la cannula tracheale collegata alla pompa respiratoria subito dopo la tracheotomia e prima dell'apertura del torace.
   3. Impostare il volume corrente a 10 mL/kg.
      nota: A seconda della configurazione dell'esperimento e del modello di torace artificiale, fornire una ventilazione a pressione positiva con la stessa pompa di ventilazione utilizzata per fornire la pressione negativa o con una diversa, garantendo una rapida ri-incannulazione.
6. Toracotomia e dissanguamento:
   1. Per accedere alla cavità toracica, utilizzare un bisturi o delle forbici per aprire la parete del torace ed eseguire una sternotomia mediale fino al terzo superiore del torace.
   2. Tenere aperte le metà del torace con due divaricatori. Diversi lembi polmonari di solito circondano il cuore.
   3. Localizzare la vena cava superiore e inferiore e riferirle con dei fili.
   4. Prima del dissanguamento dell'animale, identificare il ventricolo destro e iniettare 1000 UI/kg di eparina.
   5. Subito dopo l'iniezione, legare la vena cava superiore e inferiore con il filo pre-avvolto ed eseguire il dissanguamento.
7. Prelievo cuore-polmone:
   1. Prelevare il blocco cardiopolmonare delicatamente e rapidamente. Utilizzare la dissezione digitale diretta o le forbici a molla per separare il tessuto connettivo in modo da rimuovere i polmoni dal torace.
   2. Sezionare il sistema vascolare nell'area e l'esofago.
   3. Tagliare lo sterno del manubrio per estendere la sternotomia mediale verso la cannula tracheale, liberando la trachea su entrambi i lati dal tessuto di collegamento.
   4. Ora, reseca la trachea sopra la cannula tracheale. Tirare delicatamente la cannula su un asse craniocaudale mentre la fissazione dorsale della trachea e dei polmoni viene resecata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo Tygon E-Lab a 2 stop, diametro interno 3,17 mm, confezione da 12 pezzi, nero/bianco	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adattatore per ventilazione a pressione positiva su IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alimentazione di gas alternativa senza pressione per IPL-4: per alimentare la trachea con una miscela di gas diversa dall'aria ambiente durante la ventilazione negativa	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Unità di base per il polmone perfuso isolato da coniglio a maiale fetale	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Siero bovino A2:D41albumina liofilizzata in polvere	sigma	3912	500 g
Trasduttore differenziale di bassa pressione DLP2.5, portata +- 2,5 cmH2O, connettore HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Trasduttore di pressione differenziale MPX, campo +- 100 cmH2O, connettore HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Grado HPLC assoluto di etanolo	Caledon
Pompa peristaltica Harvard P-230 (completa di scatola di controllo e azionamento motore P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Pneumotachimetro lineare riscaldato con portata da 0 a 10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Regolatore di riscaldamento per pneumotachimetro singolo 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
eparina	Pisa		5000 interfaccia utente
Sistema centrale IPL-4 per polmone isolato da coniglio a feto di maiale, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Termostato a circolazione Lauda, tipo E-103, 230 V/50 Hz, volume bagno 3 l, intervallo di temperatura da 20 a 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Opzione di controllo della ventilazione a pressione negativa con regolatore di pressione per IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
Conigli della Nuova Zelanda
PISABENTAL (Pentobarbital sodico)	Pisa	Codice Q-7833-215
Custodia PLUGSYS, tipo 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
Modulo contatore di tempo TCM PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
Modulo amplificatore trasduttore PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
Modulo amplificatore trasduttore PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Modulo di controllo della ventilazione con regolatore di pressione	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
PROCIN (Xilacina cloridrato)	Pisa	Codice Q-7833-099
Cannula dell'arteria polmonare per coniglio con cestello, OD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Coltello da bisturi
Servocontrollore per perfusione (SCP)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Guanti chirurgici n. 7 1/2
Guanti chirurgici n. 8
Cannula tracheale per coniglio, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163