Perfusione polmonare ex vivo: una tecnica per la ricerca polmonare in un modello di coniglio

Abstract

Fonte: Pacheco-Baltazar, A., et al., Sistema di perfusione polmonare isolato nel modello di coniglio. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra una tecnica ex vivo per la perfusione polmonare isolata. Si tratta di uno strumento per la ricerca polmonare che aiuterà gli studi di vari meccanismi fisiologici e patologici coinvolti nelle procedure di trapianto di polmone.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Incannulamento:

1. Metti i polmoni del coniglio appena isolato insieme al cuore su una garza sterile su una capsula di Petri.
2. Per prevenire l'atelettasia, ventilare i polmoni utilizzando la ventilazione a pressione positiva con pressione positiva di fine espirazione (PEEP) impostata a 2 cmH₂O.
3. Rimuovere i ventricoli tagliandoli dal cuore a livello del solco atrioventricolare.
4. Dopo aver aperto i due ventricoli, introdurre la cannula dell'arteria polmonare OD 4,6 mm per il coniglio con un cestello attraverso l'arteria polmonare e introdurre la cannula dell'atrio sinistro OD 5,9 mm per il coniglio con il cestello attraverso la valvola mitrale nell'atrio sinistro.
5. Utilizzare una sutura di seta 4-0 nell'arteria polmonare e nell'atrio sinistro per fissare le cannule. Includi i tessuti circostanti nelle legature dell'arteria polmonare e dell'atrio sinistro per evitare la distensione di queste strutture.
6. Iniettare 250 mL di soluzione isotonica salina attraverso le cannule arteriose per eliminare il sangue rimanente dal letto vascolare.

2. Tecnica di perfusione:

1. apparecchio:
   1. Posizionare con cura i polmoni isolati nella camera polmonare.
   2. Fissare la trachea al trasduttore sul coperchio della camera.
   3. Collegare i vasi cannulati al sistema di perfusione.
   4. Chiudere la camera e fissarla con il blocco rotante.
      nota: Il circuito di perfusione a ricircolo è costituito da un serbatoio venoso aperto, una pompa peristaltica, uno scambiatore di calore e una trappola per bolle.
   5. A questo punto, collegare il coperchio della camera e passare su un rubinetto per passare dalla ventilazione a pressione positiva a quella negativa. Per controllare la ventilazione a pressione negativa dei polmoni e la chiusura ermetica della camera, ispezionare l'escursione respiratoria del polmone e la pressione della camera sul manometro.
   6. Perfondere i polmoni con 200 mL di perfusato artificiale privo di sangue (un tampone bicarbonato di Krebs-Ringer contenente il 2,5% di albumina bovina).
   7. Iniziare il flusso di perfusato a 3 mL/min/kg, quindi aumentare lentamente il flusso in un periodo di 5 minuti fino a 5 mL/min/kg. Raggiungere un flusso di 8 mL/min/kg nei successivi 5 minuti e poi dopo un altro periodo di 5 minuti raggiungere un flusso massimo di 10 mL/min/kg. Fare attenzione a evitare che l'aria penetri nel circuito.
      nota: Mantenere il pH e la temperatura del perfusato entro intervalli fisiologici (pH 7,4-7,5; temperatura, 37 °C-38 °C). Per regolare il pH, aggiungere NaHCO₃ (1N) o aumentare il flusso di anidride carbonica. In alternativa, utilizzare HCl (0,1N) per acidificare.
2. Parametri:
   1. Verificare se i parametri di perfusione e ventilazione predeterminati sono impostati come richiesto.
   2. Ventilare i polmoni con aria umidificata a una frequenza di 30 bpm, un volume corrente di 10 mL/kg e una pressione di fine espirazione (Pe) di 2 cmH₂O.
      nota: La pressione arteriosa polmonare (0-20 mmHg) corrisponde all'altezza del livello del liquido nell'ossigenatore o nel serbatoio in centimetri sopra il tronco polmonare, mentre la pressione venosa polmonare corrisponde all'altezza della camera di equilibrio pressorio sopra l'atrio sinistro. Entrambi i valori possono essere modificati. Si noti che anche la pressione dell'atrio sinistro è 0-20 mmHg.
3. Raggiungimento delle condizioni della zona 3:
   1. Utilizzare i due cateteri collegati alle porte laterali delle cannule fissate nell'arteria polmonare, nell'atrio sinistro e nei trasduttori di pressione per misurare le pressioni arteriosa (Pa) e venosa (Pv).
   2. Impostare le pressioni basali a livello dell'ilo polmonare (riferimento zero).
   3. Condurre gli esperimenti in condizioni di ventilazione della zona 3. Per ottenere ciò, attendere 10-15 minuti per ottenere un equilibrio caratterizzato da uno stato isogravimetrico.
   4. Assicurarsi che la pressione venosa sia superiore alla pressione alveolare (Palv) e che la pressione arteriosa rimanga superiore a entrambe (Pa > Pv > Palv) affinché si verifichino le condizioni della Zona 3.
   5. Assicurarsi che il peso dei polmoni rimanga costante e che le pressioni arteriose e atriali sinistra siano stabili per raggiungere le condizioni della zona 3 per aprire un numero massimo di vasi polmonari e mantenere il contenuto del letto microvascolare durante l'esperimento.
      nota: La misurazione di Kfc come indicatore di edema polmonare non ha variazioni tra un sistema di perfusione manuale e uno automatico.
4. Controllo elettronico ed elaborazione del segnale: garantire che il flusso respiratorio, le variazioni di peso, la pressione microvascolare, il volume corrente, la resistenza vascolare, tra gli altri, siano registrati su un'unità elettronica centrale multipla che integra i segnali provenienti dai trasduttori e li visualizza sul sistema di valutazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo Tygon E-Lab a 2 stop, diametro interno 3,17 mm, confezione da 12 pezzi, nero/bianco	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adattatore per ventilazione a pressione positiva su IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adattatore per ventilazione a pressione positiva su IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alimentazione di gas alternativa senza pressione per IPL-4: per alimentare la trachea con una miscela di gas diversa dall'aria ambiente durante la ventilazione negativa	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Unità di base per il polmone perfuso isolato da coniglio a maiale fetale	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Siero bovino A2:D41albumina liofilizzata in polvere	sigma	3912	500 g
Cloruro di calcio, CaCl2·2H2O.	JT Panettiere	Codice 10035-04-8
Fiale criogeniche	Corning	430659	2 ml
D-glucosio, C6H12O6.	sigma	G5767
Trasduttore differenziale di bassa pressione DLP2.5, portata +- 2,5 cmH2O, connettore HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Trasduttore di pressione differenziale MPX, campo +- 100 cmH2O, connettore HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Provette Eppendorf
Grado HPLC assoluto di etanolo	Caledon
Tubi Falcon			14 ml
Pompa peristaltica Harvard P-230 (completa di scatola di controllo e azionamento motore P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Pneumotachimetro lineare riscaldato con portata da 0 a 10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Regolatore di riscaldamento per pneumotachimetro singolo 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
eparina	Pisa		5000 interfaccia utente
Colonna HPLC (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4,6 mm
Filtro per siringa idrofilo	Millex	SLLGR04NL	4 millimetri
Sistema centrale IPL-4 per polmone isolato da coniglio a maiale fetale, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Sistema centrale IPL-4 per polmone isolato da coniglio a feto di maiale, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Serbatoio in vetro incamiciato per soluzione tampone, con fritta e tubo, 6,0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Termostato a circolazione Lauda, tipo E-103, 230 V/50 Hz, volume bagno 3 l, intervallo di temperatura da 20 a 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Cannula Atrio Sinistra per Coniglio con Cestello, OD 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Trasduttore di pressione sanguigna a bassa gamma P75 per modulo PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO4·7H2O	JT Panettiere	Codice 10034-99-8
Provetta per microcentrifuga	Corning	430909
Opzione di controllo della ventilazione a pressione negativa con regolatore di pressione per IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
Conigli della Nuova Zelanda
PISABENTAL (Pentobarbital sodico)	Pisa	Codice Q-7833-215
Custodia PLUGSYS, tipo 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
Modulo contatore di tempo TCM PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
Modulo amplificatore trasduttore PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
Modulo amplificatore trasduttore PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Modulo di controllo della ventilazione con regolatore di pressione	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Cloruro di potassio, KCl.	JT Panettiere	Codice 3040-01
Diidrogeno fosfato di potassio, KH2PO4	JT Panettiere	7778-77-0
Cannula dell'arteria polmonare per coniglio con cestello, OD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Servocontrollore per perfusione (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Provetta per microcentrifuga con tappo a scatto	Costar	3620	1,7 ml
Bicarbonato di sodio, NaHCO3	sigma	S6014
Cloruro di sodio, NaCl.	sigma	S9888
Guanti chirurgici n. 7 1/2
Guanti chirurgici n. 8
Tubi Taygon	Azienda Masterflex
Cannula tracheale per coniglio, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163