Consegna di molecole traccianti nella cisterna magna: un metodo per erogare molecole traccianti fluorescenti tramite incannulamento diretto della cisterna magna nel maiale

Abstract

Fonte: Bèchet, N. B., et al. Impianto diretto di cannula nella cisterna magna dei maiali. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive il protocollo per la consegna di molecole traccianti tramite incannulamento diretto della cisterna magna in un cervello di maiale. Questo metodo aiuta a visualizzare la distribuzione del liquido cerebrospinale nel sistema glinfatico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Incannulamento e iniezione

NOTA: Questo passaggio richiede almeno due persone e viene eseguito con la testa dell'animale sollevata e il collo flesso.

1. Inizia con un maiale anestetizzato, pre-operato con cisterna magna accessibile chirurgicamente.
2. Assicurati che una persona sollevi e fletti la testa e il collo dell'animale mentre l'altra palpa per la cisterna magna prendendo nota della sua posizione anatomica.
3. Introdurre lentamente e con attenzione una cannula da 22 G attraverso la dura madre e nella cisterna magna con un angolo obliquo rispetto all'asse longitudinale.
   nota: Non inserire la cannula troppo in profondità, poiché ciò può causare danni al cervello. Sapere fino a che punto inserire la cannula deriva dall'esperienza nel capire come ci si sente per la cannula a perforare la dura. In sostanza, proprio come la dura madre è stata perforata, la cannula è abbastanza profonda per un'iniezione di tracciante di successo. Questa profondità è di circa 3-5 mm, ma differirà in base alle dimensioni o all'età dell'animale. Il successo dell'incannulamento dovrebbe essere immediatamente evidente attraverso la visualizzazione di un liquido cerebrospinale chiaro e pulsante che risale la cannula. Per ottenere il miglior risultato, si consiglia di praticare in anticipo diverse incannulazioni negli animali sottoposti a eutanasia per comprendere il piercing durale.
4. Ritrarre l'ago dalla cannula e posizionare un cappuccio sulla serratura.
5. Innanzitutto, applicare la supercolla e un acceleratore nel punto in cui la cannula entra nel tessuto, quindi l'applicazione del cemento dentale. Attendere 5 minuti affinché il cemento si indurisca.
6. Rimuovere con cautela il cappuccio dalla cannula e collegare l'estremità maschio del rubinetto della linea IV con estensione di 10 cm, con il tracciante, alla cannula.
7. Iniettare lentamente il tracciante a mano o utilizzando una pompa per microinfusione a una velocità di 100 μL/min. Rimuovere il rubinetto della linea IV a 3 vie con prolunga di 10 cm e sostituirlo con il tappo. Il tracciante dovrebbe ora essere visibile pulsando alla base della cannula.
   nota: Se l'iniezione è manuale, farlo fino a quando il tracciante non è ancora visibile nello stelo della cannula, a circa 1-2 mm sopra il punto in cui il cemento dentale copre lo stelo.
8. Dopo l'iniezione, posizionare dei sacchi di sabbia sotto il collo per mantenere una certa flessione. La testa può quindi essere rilasciata e l'animale viene lasciato in posizione prona a riposo.
9. Rilasciare i divaricatori autobloccanti e posizionare i muscoli come erano stati posizionati prima. Unisci la pelle sui muscoli usando le pinze per asciugamani chirurgici.
10. Copri le pinze per asciugamani e l'incisione con una garza e poi una coperta per limitare la perdita di calore.
11. Lasciare circolare il tracciante per il tempo desiderato prima di sopprimere l'animale mediante iniezione endovenosa di pentobarbital (140 mg/kg). Confermare l'eutanasia con l'assenza di suoni cardiaci al momento dell'auscultazione con uno stetoscopio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago da 18G	Mediq
Siringa da 1 ml	FischerSci	15849152
Cannula da 20G	Mediq	Na
Cannula 22G	Mediq	Na
Albumina sierica bovina Alexa-Fluor 647 Coniugato	ThermoFischer	Codice A34785	2 fiale (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	Visualizzazione del materiale C1016
Cemento dentale	Agnthos	Codice: 7508
glucosio	Sigmaaldrich	G8270
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV linea RUBINETTO, 3 VIE con prolunga 10cm	Bbraun	Na
Kcl	Sigmaaldrich	P9333
marcatore	Na	Na
MgCl2	Sigmaaldrich	Codice: M8266
MilliQ acqua	Na	Na
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	Episodio 5761
salino	Mediq	Na
Divaricatori autobloccanti	Na	Na
Supercolla	Na	Na
Forbici curve chirurgiche	Na	Na
Pinze per asciugamani chirurgici	Na	Na