Preparazione del modello di coniglio cosciente per video-EEG-ECG-ossimetria-capnografia simultanea per interventi sperimentali: una procedura per impiantare elettrodi EEE-ECG e collegare sonde respiratorie nel modello di coniglio

Abstract

Fonte: Bosinski, C. et al., Monitoraggio multisistemico per l'identificazione di convulsioni, aritmie e apnee nei conigli trattenuti coscienti. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra la procedura per impiantare elettrodi EEG-ECG e collegare sonde respiratorie in un modello di coniglio per acquisire e analizzare le registrazioni dei suoi segnali biologici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Impianto di elettrodi EEG-ECG e collegamento di monitor respiratori

1. Rimuovi un coniglio dal trasportino e mettilo in grembo a un investigatore seduto.
2. Tieni il coniglio in verticale e tienilo vicino al corpo dell'investigatore.
3. Abbassa il coniglio in posizione supina, con la testa del coniglio alle ginocchia dell'investigatore e la testa del coniglio più bassa del resto del corpo.
   nota: Questa manovra rilassa l'animale e riduce al minimo la probabilità che cerchi di muoversi o scappare mentre posiziona gli elettrodi.
4. Ora che il coniglio è assicurato in posizione supina, chiedi a un secondo investigatore di allargare il pelo fino a quando la pelle non può essere identificata e isolata dal tessuto sottostante.
5. Inserire elettrodi piegati a 35° sottocutaneamente in ciascuna ascella (Figura 1A).
   nota: Gli elettrodi devono essere spinti in modo che siano saldamente agganciati alla pelle, ma non penetrino nelle strutture più profonde. L'ingresso e l'uscita dell'elettrodo dalla pelle (in tutto e per tutto) riduce la possibilità che gli elettrocateteri si stacchino quando si posiziona il coniglio nel sistema di contenzione o se si muove durante l'esperimento (Figura 1B). Tutti gli elettrodi sono sterilizzati con etanolo al 70% prima del posizionamento.
6. Posizionare gli elettrocateteri sul torace, posteriormente agli arti anteriori destro e sinistro e sull'addome, anteriormente all'arto posteriore sinistro. Posizionare un elettrodo a spillo di terra anteriormente all'arto posteriore destro sull'addome (Figura 2A).
7. Una volta che tutti gli elettrocateteri ECG sono posizionati correttamente, riportare il coniglio in posizione prona, con gli elettrocateteri che corrono su un lato dell'addome del coniglio, e trasferire il coniglio in un sistema di ritenuta di dimensioni adeguate (ad esempio, 6" x 18" x 6"). Quando si posiziona il coniglio nel sistema di contenzione, tirare il filo sciolto verso l'alto per evitare che il coniglio estragga gli elettrodi con le zampe. Fissare i fili al lato del sistema di ritenuta in modo che non rimangano impigliati sotto il coniglio durante l'esperimento (Figura 2B).
8. Fissare il coniglio nel sistema di ritenuta abbassando il sistema di ritenuta intorno al collo e bloccandolo in posizione. Inoltre, sposta gli arti posteriori sotto l'animale e fissa il sistema di ritenuta posteriore.
   nota: Si dovrebbe essere in grado di inserire 1-2 dita nello spazio sotto il collo per assicurarsi che non sia troppo stretto. In particolare durante gli esperimenti in cui può esserci movimento motorio, è importante stringere il sistema di ritenuta per ridurre al minimo il movimento, le potenziali lesioni spinali, la lussazione degli arti e la capacità di espellere il sistema di ritenuta posteriore (Figura 2B). I conigli sono stati mantenuti nel sistema di contenzione per ~5 ore senza problemi legati a un aumento del movimento o segni di disidratazione.
   1. Per i conigli piccoli (ad esempio, di età inferiore a 2 mesi) posizionare un cuscinetto di gomma sotto l'animale per sollevare il coniglio, che impedisce al coniglio di appoggiare il collo sul fondo del poggiatesta (Figura 2C).
      nota: Un improvviso calo della frequenza respiratoria e cardiaca può essere secondario al conflitto cervicale. In tal caso, allentare il sistema di ritenuta del collo e sollevare la testa del coniglio per alleviare la compressione del collo.
   2. Quando il sistema di ritenuta posteriore non segue fedelmente la schiena/la colonna vertebrale del coniglio, posizionare un distanziatore in PVC per impedire qualsiasi movimento che potrebbe causare lesioni spinali.
      nota: Ad esempio, un tubo in PVC lungo ~14 cm x 4" di diametro interno, con il 25-33% inferiore rimosso, può essere posizionato sopra il coniglio con schiuma per fornire un'adeguata ritenuta (Figura 2C).
9. Ora che il coniglio è posizionato saldamente nel sistema di contenzione, inserire gli elettrodi a spillo diritti sottocutanei da 7-13 mm nel cuoio capelluto (Figura 1A). Utilizzando un angolo di entrata di 45°, far passare i fili tra le orecchie e legare liberamente i fili al sistema di ritenuta dietro la testa per mantenere il posizionamento dell'elettrocatetere. Posizionare 5 derivazioni EEG nelle seguenti posizioni: anteriore destra, anteriore sinistra, occipitale destra, occipitale sinistra e una derivazione di riferimento centrale (Cz) nel punto tra le altre 4 derivazioni (Figura 2D).
   nota: Gli elettrodi sono posizionati correttamente quando sono posizionati nel tessuto sottocutaneo contro il cranio. Questo posizionamento riduce al minimo gli artefatti dal naso, dalle orecchie e da altri muscoli circostanti. Alcuni artefatti derivanti dal movimento ritmico del naso sono inevitabili. Gli elettrocateteri EEG anteriori devono essere posizionati medialmente agli occhi del coniglio e puntare anteriormente. Le derivazioni occipitali devono essere posizionate anteriormente alle orecchie e punteranno in direzione mediale. Cz è posizionato al centro della parte superiore della testa in un punto che si trova tra tutti e 4 gli elettrodi (a metà strada tra Lambda e Bregma, lungo la linea di sutura). Il perno dell'elettrodo Cz punta anteriormente.
   1. Passa i fili EEG tra le orecchie, per evitare che il coniglio cerchi di mordere i fili.
10. Collegare il pletismografo del pulsossimetro all'orecchio del coniglio sopra la vena marginale dell'orecchio.
    nota: Potrebbe essere necessario radere i peli in eccesso dall'orecchio per migliorare il segnale o utilizzare una garza per mantenere il sensore in posizione.
    1. Assicurarsi che la frequenza cardiaca sulla pletismografia sia correlata alla frequenza cardiaca dell'ECG e che la saturazione di ossigeno sia visualizzata (Figura 3C).
11. Posizionare delicatamente la maschera facciale con il tubo per capnografia sulla bocca e sul naso del coniglio (Figura 2H). Fissare la maschera facciale con lo spago avvolto attorno alla maschera e attaccare entrambe le estremità dello spago al trattenere. Collegare l'altra estremità del tubo per capnografia al monitor dei segni vitali.
    nota: È importante evitare che la corda si depositi sugli occhi del coniglio durante l'esperimento. Per fare questo, fissa la corda al centro del sistema di ritenuta tra le orecchie del coniglio. Per migliorare il segnale della capnografia, creare una valvola unidirezionale utilizzando del nastro adesivo e un sottile pezzo di nitrile che consenta all'ossigeno di entrare nel raccordo a T e diriga la CO2 espirata nel tubo della capnografia (Figura 2I).

2. Registrazione di video-EEG-ECG

1. Esecuzione di registrazioni video-EEG-ECG utilizzando un software EEG disponibile in commercio.
   nota: Gli elettrocateteri biopotenziali e il video sono bloccati nel tempo per correlare successivamente i segnali elettrici e video (ad esempio, picco EEG con un jerk mioclonico).
2. Conferma la connettività ottimale, senza deriva della linea di base, senza rumore elettrico a 60 Hz e con un elevato rapporto segnale/rumore. In particolare, assicurarsi che ogni fase della forma d'onda cardiaca possa essere visualizzata sull'ECG e che le onde delta, theta e alfa non siano oscurate visivamente dal rumore ad alta frequenza sull'EEG.
   1. Se tutti gli elettrodi producono una quantità eccessiva di rumore, regolare il cavo di riferimento centrale. Se un solo elettrodo è eccessivamente rumoroso, spingerlo più in profondità nella pelle o riposizionarlo fino a quando non c'è più metallo esposto.
3. Regolare il video in modo che tutti i conigli possano essere visti contemporaneamente, il che consente la correlazione dell'attività motoria con i risultati dell'EEG (Figura 3A).
   nota: Il sistema è in grado di effettuare registrazioni simultanee di EEG/ECG/ossimetria/capnografia di un massimo di 7 conigli.
4. Avviare la registrazione di base da ciascun animale per un minimo di 10-20 minuti o fino a quando la frequenza cardiaca non si stabilizza in uno stato calmo e rilassato (200-250 bpm) e i conigli non mostrano movimenti abbondanti per almeno 5 minuti. Acquisire dati elettrografici a larghezza di banda completa senza filtri. Per una migliore visualizzazione dei dati, impostare il filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) a 1 Hz e il filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) a 59 Hz.
   nota: Un altro segno che il coniglio è rilassato è l'insorgenza dei fusi del sonno EEG (discussi più avanti).
5. Aggiungi note bloccate nel tempo durante l'esperimento in tempo reale per indicare i tempi degli interventi (ad esempio, somministrazione di farmaci) e gli eventi neuro-cardiaci (ad esempio, picco EEG, convulsioni motorie, battito ectopico e aritmie) e arte>nota: A causa della frequenza con cui lo sperimentatore deve applicare un intervento (ad esempio, stimolazione fotica, somministrazione di farmaci), per ridurre al minimo lo stress di un ricercatore che entra ed esce dalla stanza e apre/chiude la porta, lo sperimentatore rimane sul lato opposto della stanza per tutta la durata dell'esperimento. L'investigatore si siede il più lontano possibile dall'animale e rimane fermo e silenzioso per ridurre al minimo il potenziale disturbo degli animali.

Risultati

Figura 1: Immagine degli elettrodi EEG ed ECG. (A) Elettrodi ECG piegati ed elettrodi EEG diritti. (B) Come agganciare l'elettrodo ECG nel tessuto sottocutaneo del coniglio, in modo che sia in tutto e per tutto. Abbreviazioni (LL: arto sinistro, RA: braccio destro, RL: arto destro, LA: braccio sinistro, RF: frontale destro, LF: frontale sinistro, Cz: centro, RO: occi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
computer	valletta	Optiplex 5040	Computer di acquisizione
Elettrodo ECG	Collegamento ritmico	RLSND116-2,5	Elettrodi a perno sottodermico piegati a 35 gradi da 13 mm (diametro 0,4 mm)
Elettrodo EEG	Collegamento ritmico	RLSP513	Elettrodi a perno sottodermico diritti da 13 mm (diametro 0,4 mm) a 5 torsioni
EEGLAB (2020)	Centro Swartz per le Neuroscienze Computazionali	Accesso aperto	Può eseguire l'analisi spettrale dell'EEG
Adattatore da Ethernet a Ethernet	Linksys	USB3G16	Adattatore per il collegamento della fotocamera al computer
Imbottitura in schiuma	generico	N/A	Riduce la pressione applicata al collo dei conigli piccoli dal sistema di contenzione al fine di prevenire gli effetti cardiorespiratori negativi della compressione del collo
MATLAB (R2019b, Aggiornamento 5)	MathWorks	N/A	Necessario per eseguire EEGLAB
microfono	Sony Stereo	ECM-D570P	Registrazione delle manifestazioni udibili delle convulsioni
Nastro medicale Micropore, carta, bianco	3M	Anno 1530-1	Utilizzato per fissare i fili e creare una stecca per l'orecchio
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Software di acquisizione e revisione
Stimolatore fotico	erba	PS22	Stimolatore per il controllo della frequenza, del ritardo, della durata, dell'intensità degli impulsi luminosi
Organizer / insaccatore in filo di plastica	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Fasciare i fili per ridurre il rumore
PS 22 Stimolatore fotico	Strumenti per erba	BZA641035	Luce stroboscopica con frequenza, ritardo e intensità del flash regolabili
Tubo rigido in PVC	generico	N/A	Impedisce ai conigli piccoli di scalciare le zampe posteriori e causare lesioni alla colonna vertebrale
Rabbit Resrain	Plas-Labs	501-TC	Sono disponibili contenitori per conigli di varie dimensioni. 6 "x 18" x 6 "in questo studio.
Cuscinetto in gomma (booster)	generico	N/A	Solleva piccoli conigli nel sistema di contenimento per prevenire la compressione del collo
Clip per orecchie SpO2	NONINA	61000	PureSAT/SpO2
Adattatore per sensore SpO2	NONINA	Codice: 13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Alcohol Prep, sterile, grande, 2 veli	Covidien	Codice: 5110	Per preparare la vena auricolare prima del cateterismo
LabChart Pro (2019, versione 8.1.16)	STRUMENTI AGGIUNTIVI	N/A	Analisi ECG
Amplificatore quantistico	Natus	Codice: 13926	Amplificatore / digitalizzatore
Amplificatore Quantum HeadBox	Natus	Codice 22134	Breakout box a 64 pin
Telecamera PTZ SRG-X120 1080p con uscita HDMI, IP e 3G-SDI	Sony	SRG-X120	Fotocamera Impela