Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
I conigli bianchi neozelandesi sono stati soppressi con un sovradosaggio di Pentobarbital (150 mg/kg) diluito in NaCl allo 0,9% iniettato per via intraperitoneale e gli occhi sono stati enucleati immediatamente dopo il sacrificio.
1. Prima della preparazione
- Preparare un terreno completo (F12 di DMEM/Ham integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 80 U/mL di penicillina / 80 μg/mL di streptomicina e 2,5 μg/mL di amfotericina B). Scaldare il substrato, 1x PBS e lo 0,25% di tripsina (se necessario) a bagnomaria a 37 °C.
- Mettere un telo sterile nel cofano per preparare un posto di lavoro asettico. Introdurre tutti gli strumenti e i materiali sterili necessari all'interno della cappa.
nota: Solo l'enucleazione degli occhi e la pulizia del tessuto muscolare rimanente e della pelle sono le procedure eseguite al di fuori del cappuccio, il resto dei passaggi deve essere eseguito all'interno del cappuccio.
2. Isolamento di cellule PE di coniglio
- Usa le forbici curve e le pinze Colibrì per enucleare gli occhi dopo l'eutanasia dell'animale. Pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi usando forbici e pinze (non sterili).
nota: La dimensione delle forbici e delle pinze utilizzate per l'enucleazione e la pulizia degli occhi dipende dalla specie (ad esempio, per ratti e topi gli strumenti saranno più piccoli di quelli utilizzati per suini e bovini) (vedi Figura 1).
- Raccogliere gli occhi in una provetta da 50 ml riempita con PBS non sterile e trasferire la provetta nella cappa a flusso laminare. Disinfettare gli occhi immergendoli per 2 minuti in una soluzione a base di iodio, quindi trasferirli in una capsula di Petri riempita con PBS sterile.
- Apertura della lampadina
- Metti un occhio su una garza sterile e tienila saldamente vicino al nervo ottico. Aprire l'occhio con il bisturi #11 e le forbici a circa 2 mm sotto il limbus. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, cristallino e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.
- Isolamento di celle IPE
- Rimuovere la lente e con una pinza sottile estrarre delicatamente l'iride contenente le celle IPE. Mettere l'iris in una capsula di Petri, lavarla con PBS sterile e lasciarla in PBS fino a quando non saranno preparate altre iris. Rimuovere il corpo ciliare dall'iride tagliandolo con un bisturi #10.
- Dopo la preparazione di 2 iris, incubare con 1 mL di tripsina allo 0,25% a 37 °C per 10 minuti; durante questo periodo, le cellule RPE possono essere isolate (vedere passaggio 2.4). Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di terreno completo all'iride e isolare le cellule grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco. Risospendere accuratamente le cellule mediante pipettaggio e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare e diluire 1:3 con blu di tripano per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Se non trasfettato immediatamente, seminare 200.000 cellule/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti (100.000 cellule/cm2) in 1 mL di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedere la Tabella 1). Porre la piastra in un incubatore e coltivarla a 37 °C, 5% CO2.
nota: Potrebbe essere necessario riunire diversi occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.
- Isolamento delle cellule RPE
- Rimuovere l'umor vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinza sottile. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico.
- Metti una garza sterile in una piastra a 12 pozzetti e metti il bulbo sopra la garza.
- Lavare con PBS. Aggiungere 50 μl di tripsina allo 0,25% per occhio e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina e aggiungere 150 μl di terreno completo per globo e raschiare delicatamente le cellule RPE con una pipetta Pasteur ricurva lucidata a fuoco; Usa una pinza sottile per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in una provetta da 1,5 mL. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare; diluire 1:4 con blu di tripano per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 x g.
- Se non trasfettato immediatamente, seminare 200.000 cellule/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti (100.000 cellule/cm2) in 1 mL di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedere la Tabella 1). Porre la piastra in un incubatore e coltivarla a 37 °C, 5% CO2.
nota: Potrebbe essere necessario riunire diversi occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.