Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Prima della preparazione
- Preparare un terreno completo (F12 di DMEM/Ham integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 80 U/mL di penicillina / 80 μg/mL di streptomicina e 2,5 μg/mL di amfotericina B). Scaldare il substrato, 1x PBS e lo 0,25% di tripsina (se necessario) a bagnomaria a 37 °C.
- Mettere un telo sterile nel cofano per preparare un posto di lavoro asettico. Introdurre tutti gli strumenti e i materiali sterili necessari all'interno della cappa.
NOTA: Solo l'enucleazione degli occhi e la pulizia del tessuto muscolare rimanente e della pelle vengono eseguite al di fuori del cappuccio, il resto dei passaggi deve essere eseguito all'interno del cappuccio.
- Gli occhi di maiale sono stati prelevati da un macello locale entro 6 ore dal sacrificio e sono stati trasportati in laboratorio su ghiaccio
2. Isolamento di cellule di PE di maiale
- Usa le forbici curve e le pinze Colibrì per enucleare gli occhi dopo l'eutanasia dell'animale. Pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi usando forbici e pinze (non sterili).
nota: La dimensione delle forbici e delle pinze utilizzate per l'enucleazione e la pulizia degli occhi dipende dalla specie (ad esempio, per ratti e topi gli strumenti saranno più piccoli di quelli utilizzati per suini e bovini) (vedi Figura 1).
- Raccogliere gli occhi in una provetta da 50 ml riempita con PBS non sterile e trasferire la provetta nella cappa a flusso laminare. Disinfettare gli occhi immergendoli per 2 minuti in una soluzione a base di iodio, quindi trasferirli in una capsula di Petri riempita con PBS sterile.
- Dopo aver trasferito gli occhi in una capsula di Petri sterile, tienine uno saldamente vicino al nervo ottico con Colibri o una pinza appuntita. Praticare un foro vicino al limite dell'iride (tra la pars plana e l'ora serrata) con un ago da 18 G. Inserisci delle piccole forbici nel foro e taglia intorno all'iride. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, cristallino e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.
3. Isolamento delle celle IPE
- Rimuovere il corpo ciliare dall'iride tagliandolo con un bisturi #10. Dopo la preparazione di 2 iris, aggiungere 1 mL di terreno completo e isolare le cellule grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare e diluire 1:4 con blu di tripano per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Se non trasfettato immediatamente, seminare 200.000 cellule/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti (100.000 cellule/cm2) in 1 mL di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedere la Tabella 1). Porre la piastra in un incubatore e coltivarla a 37 °C, 5% CO2.
nota: Potrebbe essere necessario riunire diversi occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.
4. Isolamento delle cellule RPE
- Eseguire il passaggio 1.1.1. Mettere il bulbo in una capsula di Petri e lavare con PBS. Riempire il bulbo con 1 ml di terreno completo.
- Utilizzando una pipetta Pasteur curva lucidata a fuoco, rimuovere con cura le cellule RPE. Assicurati di raschiare dal basso verso l'alto per evitare di scivolare verso il basso del complesso di membrana coroide-Bruch. Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 μl e trasferirla in una provetta da 1,5 mL per la risospensione. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare e diluire 1:8 con blu di tripano per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Seminare le cellule come descritto nel passaggio 3.2.
