Isolamento di cellule IPE e RPE: una tecnica per ottenere cellule epiteliali pigmentate da occhio suino isolato

Abstract

Fonte: Bascuas T. et al., Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video descriviamo una tecnica per isolare le cellule epiteliali pigmentate dell'iride e della retina dagli occhi dei suini per ottenere le loro colture primarie per studi in vivo ed ex vivo. Queste cellule pigmentate potrebbero essere geneticamente modificate per studiare approcci rigenerativi per il trattamento dei disturbi oculari.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Prima della preparazione

1. Preparare un terreno completo (F12 di DMEM/Ham integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 80 U/mL di penicillina / 80 μg/mL di streptomicina e 2,5 μg/mL di amfotericina B). Scaldare il substrato, 1x PBS e lo 0,25% di tripsina (se necessario) a bagnomaria a 37 °C.
2. Mettere un telo sterile nel cofano per preparare un posto di lavoro asettico. Introdurre tutti gli strumenti e i materiali steri....

Risultati

specie	Trattamento con tripsina	N° celle IPE	N° celle RPE	Piastra per la semina (100.000 celle/cm2)
maiale	No	~1.000.000	~3.000.000	Piastre a 24 pozzetti

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 12 pozzetti	Corning	353043
Piastre a 24 pozzetti	Corning	353047
Betadina	Mundipharma
Bonn micro pinza piatta
Pinze Colibri (sterili)
F12 di DMEM/Ham	Sigma-Aldrich	D8062
FBS	Brunschwig	P40-37500
Pinze (diverse dimensioni) (sterili)
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Ago (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Camera di Neubauer	Marienfeld-superior	Codice 640010
Pipetta Pasteur (lucidante a fuoco)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillina/Streptomicina	Sigma-Aldrich	P0781-100
Petri	ThermoFisher Scientifico	150288
Scarpel n. 10	Swann-Morton	501
Scarpel n. 11	Swann-Morton	503
Forbici Bonn extra fini curve a punta affilata (sterili)
Punta affilata dritta Extra Fine Bonn Forbici (sterili)
Citometro a immagini Tali	ThermoFisher Scientifico	T10796
Tripsina 0,25%	ThermoFisher Scientifico	25050014
Tripsina 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Forbici a molla Vannas curve (sterili)