Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Sterilizzazione
- FASE CRITICA: Disinfettare tutte le pinze e le forbici immergendole per 1 ora in una soluzione al 5% (v/v) di Distel in acqua distillata, pulire con un pennello, sciacquare con acqua di rubinetto e sterilizzare in forno a 185 °C per un minimo di 2 ore.
- Sterilizzare tutte le altre vetrerie e i reagenti in autoclave a 121 °C per 15 minuti o preparare i reagenti secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le seguenti procedure in una cabina di sicurezza per microbiologia di classe II.
2. Raccolta campioni
- Collezione di occhi suini
- Grandi scrofe autoctone bianche, è stato utilizzato un incrocio con un cinghiale dell'Hampshire. Gli animali sono stati storditi con una corrente elettrica e gli occhi sono stati enucleati 2 ore dopo nel macello.
- FASE CRITICA: Una volta enucleati, trasferire gli occhi in laboratorio in una soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) per evitare che si secchino ed elaborarli immediatamente all'arrivo.
3. Preparazione del bottone corneosclerale
- Usa una pinza sterile per trattenere il tessuto che circonda il bulbo oculare e trasferiscilo in una capsula di Petri. Rimuovere la congiuntiva e il tessuto muscolare intorno al bulbo oculare su una capsula di Petri utilizzando la lama del bisturi n. 15 e una pinza.
- Sollevare delicatamente il bulbo oculare tenendo premuto il nervo ottico con una pinza e trasferirlo in un barattolo da 0,5 L riempito con PBS sterile.
- Una volta che tutti gli occhi sono stati ripuliti dal tessuto circostante, spostarli con una pinza sterile in un altro barattolo da 0,5 L riempito con il 3% (v/v) di iodio povidone in PBS e lasciare agire per 1 minuto.
- Trasferire i bulbi oculari in un altro barattolo da 0,5 L con PBS sterile.
- Usa una pinza per tenere fermo l'occhio su una capsula di Petri e fai un taglio vicino alla cornea con una lama di bisturi n. 10A.
- PASSAGGIO CRITICO: Tenere il bordo del taglio e utilizzare le forbici per asportare la cornea lasciando circa 3 mm di sclera che circonda la cornea. Assicurati che l'estremità affilata delle forbici non fori l'iride o il tessuto coroideale e si trovi nello spazio sopra-coroideale.
- Tenere premuto il bottone corneosclerale con una pinza e utilizzare un altro paio di pinze terminali appuntite per separare delicatamente il tessuto uveale.
- Sollevare il bottone corneosclerale dal globo rimanente e sciacquarlo brevemente in una soluzione di iodio povidone all'1,5% (v/v) in PBS in una piastra a 12 pozzetti.
- Posizionare il bottone corneosclerale in un'altra piastra a 12 pozzetti riempita con PBS sterile.
