Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Preparazione di un inoculo
- Versare 10 ml di brodo LB in un pallone conico da 50 ml con un tappo di schiuma.
- Trasferire una colonia di P. aeruginosa ceppo PAO1 o PA14 da una piastra di agar fresca e incubare a 37 °C per 3-4 ore fino a quando i batteri non sono in fase di metà logaritmica.
- Trasferire la coltura batterica in una provetta da 50 mL e centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PBS.
- Ripetere il passaggio 1.3 altre due volte per lavare le celle. Risospendere il pellet di cella in PBS e regolare la densità ottica a 600 nm a circa 0,6 utilizzando PBS sterile come bianco.
2. Infettare il bottone corneosclerale
- Rimuovere il terreno dalla capsula di Petri e sciacquare le cornee due volte con 1 mL di PBS sterile.
- Stringere delicatamente la pinza tenendo la cornea in mezzo. Utilizzare un bisturi 10A per eseguire quattro tagli, due verticali, due orizzontali, nella sezione centrale del bottone corneosclerale attraverso lo strato epiteliale fino allo stroma sottostante.
- Posizionare uno stampo di vetro sterile in una piastra a 6 pozzetti con la parte larga rivolta verso l'alto e posizionare la cornea al centro dello stampo di vetro, con il lato dell'epitelio rivolto verso il basso. Fai il taglio proprio al centro della parte inferiore dello stampo in vetro.
- FASE CRITICA: Versare 1 mL di agar a basso punto di fusione all'1% (p/v) disciolto in DMEM per riempire completamente lo stampo di vetro con la cornea.
- Lasciare solidificare l'agar e poi capovolgere lo stampo di vetro in modo che l'epitelio corneale sia rivolto verso l'alto.
- Pipettare 15 μL di coltura batterica con OD600nm = 0,6 (per P. aeruginosa ciò equivale a circa 1 x 107 unità formanti colonie (CFU) in 15 μL) direttamente in un'area tagliata e quindi aggiungere 85 μL di PBS in cima per mantenere umido l'epitelio corneale. Diluire la coltura batterica rimanente e la piastra su agar per contare le unità formanti colonie per l'inoculo.
- Aggiungere 1 mL di DMEM senza antibiotici sul fondo di ogni pozzetto con lo stampo di vetro. Incubare la piastra a 6 pozzetti con i bottoni corneosclerali infetti in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per un massimo di 24 ore.
- Imposta la cornea di controllo non infetta insieme a ogni esperimento. Per impostare il controllo non infetto, sostituire i 15 μl di coltura batterica nella fase 2.6 con PBS sterile.
