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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione di tessuto polmonare di maiale ex vivo (EVPL)
- Procurarsi i polmoni dalla fonte designata il prima possibile dopo la macellazione, assicurandosi che siano mantenuti freddi trasportandoli in laboratorio in una cella frigorifera domestica.
nota: I polmoni più vicini al giorno della macellazione mostrano meno lividi dovuti alla conservazione, ma possono essere utilizzati anche tessuti conservati in celle frigorifere per un massimo di 4 giorni dalla macellazione. Poiché la scatola frigorifera deve essere portata in macelleria o al macello, deve essere decontaminata seguendo le linee guida del laboratorio locale dopo ogni utilizzo e conservata al di fuori del laboratorio di microbiologia quando non viene utilizzata, per ridurre il rischio di contaminazione e violazione del contenimento.
- Lavorando su una superficie sterilizzata e sotto una fiamma, posizionare i polmoni su un tagliere di plastica pulito ricoperto di un foglio di alluminio autoclavato. Controllare che i bronchioli rimangano integri. In caso di danni al macello o durante il trasporto, i polmoni non sono idonei all'uso.
- Scaldare una spatola sotto una fiamma e toccare molto brevemente il coltello nell'area del polmone che circonda il bronchiolo per sterilizzare la superficie del tessuto.
- Tagliare il tessuto superficiale che circonda il bronchiolo utilizzando una lama di rasoio montata in modo sterile. Praticare delle incisioni parallele al bronchiolo per evitare danni.
- Una volta che il bronchiolo è stato esposto, praticare un'incisione in sezione trasversale attraverso il bronchiolo nel punto più alto visibile per liberare il bronchiolo.
- Usando una pinza sterile, tieni leggermente l'estremità libera del bronchiolo e taglia via il tessuto indesiderato rimanente usando una lama di rasoio montata in modo sterile. Praticare un'ultima incisione della sezione trasversale attraverso il bronchiolo prima che siano visibili eventuali ramificazioni per rimuovere il bronchiolo dai polmoni.
- Posizionare le bronchiole nel primo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciare il bronchiolo nel lavaggio e ripetere i passaggi 1.2-1.5 per raccogliere ulteriori sezioni di bronchiolo dallo stesso polmone, come richiesto per produrre sezioni di tessuto sufficienti.