Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione e infezione del tessuto polmonare di maiale ex vivo (EVPL)
- Preparare l'SCFM per l'uso con il tessuto EVPL, seguire la ricetta per 1 L di SCFM modificato fornita nella Tabella 1.
- Prima della dissezione, preparare una o più piastre di agar del ceppo batterico o dei ceppi batterici necessari per l'infezione utilizzando qualsiasi agar standard in laboratorio per P. aeruginosa/S. aureus (ad esempio, brodo di lisogenesi + 1,2% di agar).
- Calcolare quanti pezzi di tessuto bronchiolare suino sono necessari per l'esperimento, compresi i pezzi di tessuto di controllo non infetti. Moltiplicare questo numero per due per ripetere l'esperimento in due polmoni replicati per confermare la ripetibilità dei risultati.
- Moltiplicare il numero totale di pezzi di tessuto necessari per 0,5 per determinare il volume di agarosio SCFM (mL) necessario per produrre tamponi di agarosio in modo da produrre un terreno sufficiente per 400 μL/pezzo di tessuto più l'agar SCFM di ricambio per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio o evaporazione durante la preparazione.
- Aggiungere 0,12 g di agarosio ogni 15 ml di SCFM necessari per ottenere il volume totale desiderato di SCFM con lo 0,8% in peso/volume di agarosio.
- Riscaldare la soluzione di agarosio SCFM fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto. Si consiglia un forno a microonde domestico a bassa potenza. Il tempo necessario dipende dalla potenza del microonde. Lasciare raffreddare l'agarosio a circa 50 °C (caldo al tatto ma comodo da tenere in mano). Non lasciare raffreddare ulteriormente.
- Utilizzando una pipetta, aggiungere 400 μl di agarosio SCFM a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per ogni pezzo di tessuto necessario.
- Sterilizzare la piastra/e a 24 pozzetti contenente agarosio SCFM sotto luce ultravioletta per 10 minuti.
- Preparare tre lavaggi replicati per ogni polmone intatto da sezionare utilizzando 20 mL di terreno sterile Dulbecco's modified Eagle (DMEM) più 20 mL di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sterile integrati con 50 μg/mL di ampicillina.
- Effettuare un'aliquota di 40 mL di SCFM come lavaggio finale per ogni polmone intatto da sezionare. Tutti i lavaggi possono essere conservati durante la notte a 4 °C o utilizzati immediatamente.
- Procurarsi i polmoni dalla fonte designata il prima possibile dopo la macellazione, assicurandosi che siano mantenuti freddi trasportandoli in laboratorio in una cella frigorifera domestica.
nota: I polmoni più vicini al giorno della macellazione mostrano meno lividi dovuti alla conservazione, ma possono essere utilizzati anche tessuti conservati in celle frigorifere per un massimo di 4 giorni dalla macellazione. Poiché il frigorifero deve essere portato in macelleria o al macello, deve essere decontaminato seguendo le linee guida del laboratorio locale dopo ogni utilizzo e conservato al di fuori del laboratorio di microbiologia quando non viene utilizzato, per ridurre il rischio di contaminazione e violazione del contenimento.
- Lavorando su una superficie sterilizzata e sotto una fiamma, posizionare i polmoni su un tagliere di plastica pulito ricoperto di un foglio di alluminio autoclavato. Controllare che i bronchioli rimangano integri. In caso di danni al macello o durante il trasporto, i polmoni non sono idonei all'uso.
- Scaldare una spatola sotto una fiamma e toccare molto brevemente il coltello nell'area del polmone che circonda il bronchiolo per sterilizzare la superficie del tessuto.
- Tagliare il tessuto superficiale che circonda il bronchiolo utilizzando una lama di rasoio montata in modo sterile. Praticare delle incisioni parallele al bronchiolo per evitare danni.
- Una volta che il bronchiolo è stato esposto, praticare un'incisione in sezione trasversale attraverso il bronchiolo nel punto più alto visibile per liberare il bronchiolo.
- Usando una pinza sterile, tieni leggermente l'estremità libera del bronchiolo e taglia via il tessuto indesiderato rimanente usando una lama di rasoio montata in modo sterile. Praticare un'ultima incisione della sezione trasversale attraverso il bronchiolo prima che siano visibili eventuali ramificazioni per rimuovere il bronchiolo dai polmoni.
- Posizionare le bronchiole nel primo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciare il bronchiolo nel lavaggio e ripetere i passaggi da 1.12 a 1.15 per raccogliere ulteriori sezioni di bronchiolo dallo stesso polmone come richiesto per produrre sezioni di tessuto sufficienti per l'esperimento pianificato.
- Inserire eventuali sezioni bronchiolari aggiuntive dello stesso polmone nel lavaggio (passaggio 1.17). Lasciare in lavatrice per almeno 2 min.
- Rimuovere i bronchioli dal primo lavaggio DMEM/RPMI 1640 e posizionare i campioni in una piastra di Petri sterile.
- Tenere leggermente ogni bronchiolo con una pinza sterile, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto. Rimuovere il più possibile il tessuto molle rimanente e tagliare il tessuto in strisce larghe ~5 mm utilizzando le forbici sterili per dissezione.
- Posizionare tutte le strisce di tessuto bronchiolare nel secondo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciare in lavatrice per almeno 2 min.
- Rimuovere le strisce di tessuto dal secondo lavaggio utilizzando una pinza sterile, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto. Metti il fazzoletto in una capsula di Petri pulita e sterile.
- Rimuovere i residui di tessuto molle attaccati al bronchiolo e tagliare le strisce in quadrati (~5 mm x 5 mm) utilizzando le forbici sterili per dissezione.
- Aggiungere il terzo lavaggio DMEM/RPMI 1640 nella piastra di Petri. Mescolare leggermente i pezzi di fazzoletto nel bucato facendo roteare il piatto.
- Versare il terzo lavaggio dalla capsula di Petri senza rimuovere i pezzi di tessuto.
- Aggiungere il lavaggio SCFM finale alla piastra di Petri contenente tessuto, assicurandosi che tutti i pezzi di tessuto siano coperti.
- Sterilizzare i pezzi di tessuto in SCFM sotto la luce UV per 5 minuti.
- Utilizzare una pinza sterile per trasferire ogni pezzo di tessuto bronchiolare sterilizzato in pozzetti individuali di una piastra da 24 pozzetti contenente tamponi di agarosio SCFM.
- Per infettare ogni pezzo di tessuto con il ceppo batterico desiderato, toccare una colonia coltivata su una piastra di agar con la punta di un ago da 29 G attaccata a una siringa da insulina sterile da 0,5 ml. Quindi toccare la colonia sul pezzo di tessuto, pungendo delicatamente la superficie del tessuto.
nota: L'uso di una siringa da insulina dotata di un ago da 29 G consente di impugnare l'ago in modo preciso e confortevole, mantenendo le dita a distanza di sicurezza sia dall'ago che dal tessuto polmonare. È possibile eseguire questo passaggio utilizzando aghi da 29 G che non sono attaccati a una siringa, ma ciò richiede una maggiore destrezza e aumenta il rischio di lesioni da aghi. Le siringhe da insulina sono prontamente disponibili.
- Per i controlli non infetti, pungere delicatamente la superficie di ciascuno dei pezzi di tessuto con la punta di un ago da 29 G collegato a una siringa da insulina sterile da 0,5 ml.
- Utilizzare una pipetta per aggiungere 500 μl di SCFM a ciascun pozzetto.
- Sterilizzare una membrana sigillante traspirante per ogni piastra a 24 pozzetti sotto luce ultravioletta per 10 minuti (Tabella dei materiali).
- Rimuovere il/i coperchio/i dalla/e piastra/e da 24 pozzetti e sostituirlo con la membrana traspirante.
- Incubare le piastre a 37 °C per il tempo di incubazione (infezione) desiderato senza agitare. Controllare che non vi siano crescite visibili dell'agente patogeno inoculato sui pezzi di controllo non infetti (controllo della contaminazione).
nota: Se lo si desidera, l'ampicillina può essere aggiunta ai tamponi di agarosio SCFM e alla copertura SCFM nella fase 1.31 fino a una concentrazione finale di 20 μg/mL. Ciò sopprimerà la crescita della maggior parte dei batteri endogeni sui polmoni senza influenzare la crescita di P. aeruginosa o S. aureus ma, poiché la presenza di ampicillina può influenzare la suscettibilità ad altri antibiotici, il lettore è lasciato a fare questa scelta a seconda dei ceppi e degli antibiotici che desidera testare.
TABELLA 1
1. Preparazione del terreno sintetico di espettorato CF (SCFM) per l'uso con il modello di polmone di maiale ex vivo
Una volta realizzato, l'SCFM deve essere sterilizzato con filtro e può quindi essere conservato a 4°C per un massimo di un mese.
sopra il livello del mare
| a) Ricetta principale |
| Passaggio 1 | chimico | importo | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| NaCl | 3,03 g | Aggiungi sali e acqua alla bottiglia pulita, utilizzata solo per la preparazione di SCFM | 51,85 |
| Kcl | 1,114 grammi | Ore 14.94 |
| dH2O | 640 ml | N/A |
| Passaggio 2 | chimico | Molarità del brodo in acqua, sterilizzato con filtro e conservato a 4°C | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| Na2HPO4 | 0,125 m sopra il livello del mare | Aggiungi 10 ml di ogni brodo ai sali e all'acqua preparati nel passaggio 1 | 1.25 |
| NaH2PO4 | 0,13 milioni | Ore 1.30 |
| NH4Cl | 0,228 m sopra il livello del mare | 2.28 |
| KNO3 | 0,0348 milioni | 0,35 |
| K2SO4 | 0,0271 milioni | 0,27 |
| Mops | 1 M | Ore 10.00 |
| Passaggio 3 | chimico | | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| 19 soluzioni di aminoacidi preparate secondo la sezione b) | Aggiungere 10 ml di ciascun brodo alla soluzione preparata nei passaggi 1 e 2. | Vedi sezione b) |
| Passaggio 4 | Chimico | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| HCl o NaOH come richiesto | Utilizzare per regolare il pH della soluzione preparata nei passaggi da 1-3 a 6.8. Volume record di acido/base aggiunto. | N/A |
| Passaggio 5 | Chimico | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| dH2O | Aggiungere alla soluzione preparata nei passaggi 1-4, fino a un volume finale di 960 ml | N/A |
| Passaggio 6 | chimico | Molarità del brodo in acqua, sterilizzato con filtro e conservato a 4°C | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| CaCl2 | 0,175 m sopra il livello del mare | Aggiungi 10 ml di ogni brodo alla soluzione preparata nei passaggi 1-5 | 1.75 |
| MgCl2 | 0,0606 m sopra il livello del mare | 0,61 |
| Passaggio 7 | chimico | Molarità del brodo in acqua, sterilizzato con filtro e conservato a 4°C | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| Acido L-lattico | 0,93 milioni | Fare brodo in acqua, pH a 7 con 5M NaOH. Aggiungere 10 ml alla soluzione preparata nei passaggi 1-6. | Ore 9.30 |
| Passaggio 8 | chimico | Molarità del brodo di lavoro realizzato in acqua, immediatamente prima di aggiungerlo alla ricetta | disposizioni | mM finale in 1L SCFM |
| Fe(III)SO4.7H2O | 0,00036 m | Preparare un master stock da 0,036 M, che può essere sterilizzato con filtro e conservato a 4°C per tutto il tempo in cui la soluzione rimane priva di precipitato. Per creare il materiale di lavoro, aggiungere 110 μl del brodo master a 9,890 ml di dH2O e aggiungere il pezzo grezzo alla soluzione preparata nei passaggi 1-7. | 0,0036 |
| b) Preparazione di scorte di aminoacidi; filtrare, sterilizzare prima dell'uso e conservare a 4°C. |
| amminoacido | Azioni mM | disposizioni | mM finale in 1 L SCFM |
| alanina | 178 | Sciogliere in acqua | 1.780 |
| arginina | 30,6 | Sciogliere in acqua | 0,306 |
| aspartato | 82,7 | Sciogliere in 0,5 m NaOH | 0,827 |
| cisteina | 16 | Sciogliere in acqua | 0,160 |
| acido glutammico | 154,9 | Sciogliere in 1 m di HCl | 1.549 |
| glicina | 120,3 | Sciogliere in acqua | 1.203 |
| istidina | 51,9 | Sciogliere in acqua | 0,519 |
| isoleucina | 112,1 | Sciogliere in acqua riscaldando a 50°C per 30 minuti su uno shaker | 1.121 |
| leucina | 160,9 | Sciogliere in acqua | 1.609 |
| lisina | 212,8 | Sciogliere in acqua | 2.128 |
| metionina | 63,3 | Sciogliere in acqua | 0,633 |
| Ornitina-HCl | 67,6 | Sciogliere in acqua | 0,676 |
| fenilalanina | 53 | Sciogliere in acqua | 0,530 |
| prolina | 166 | Sciogliere in acqua | 1.660 |
| serina | 144,6 | Sciogliere in acqua | 1.446 |
| treonina | 107,2 | Sciogliere in acqua | 1.072 |
| triptofano | 1.3 | Sciogliere in 0,2 m NaOH | 0,013 |
| tirosina | 80,2 | Dissolvi in 1M NaOH | 0,802 |
| valina | 111,7 | Sciogliere in acqua | 1.117 |
