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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione del tessuto
- Preparare il tessuto suino utilizzando un'area di lavoro di dissezione non sterile.
- Procurati occhi suini enucleati da un macello locale, da studi sugli animali o da un venditore. Mantenere gli occhi sul ghiaccio immerso nel PBS durante la consegna e utilizzare immediatamente dopo la ricezione.
- Tagliare il tessuto extraorbitale e rifilare la congiuntiva lasciando solo il guscio corneosclerale e il nervo ottico. Eseguire la dissezione in condizioni non sterili con grandi forbici chirurgiche e pinze in una confezione di strumenti per dissezione grossolana.
- Riposizionare gli occhi in PBS fresco su ghiaccio fino a quando tutti gli occhi necessari per la configurazione sperimentale sono stati sezionati preliminarmente/grossolanamente.
- Immergere gli occhi in una soluzione di betadina al 10% per 2 minuti in contenitori chiusi e trasferire asetticamente nell'armadio BSC II per la microdissezione (armadio #1). Eseguire tutti i lavori successivi in condizioni sterili per ridurre al minimo le contaminazioni durante l'installazione.
- Sezionare sterilemente i segmenti anteriori.
- Dopo 2 minuti in soluzione di betadina, trasferire gli occhi in tre lavaggi seriali di 1x antibiotico-antimicotico-PBS (AA-PBS) sterile per rimuovere la soluzione di betadina in eccesso dalla superficie oculare mantenendo la sterilità del tessuto oculare. Dopo tre lavaggi, mantenere il fazzoletto in AA-PBS fino a nuovo utilizzo.
- Emisectare l'occhio usando una lama di rasoio/bisturi e forbici curve. Posizionare l'occhio su una garza imbevuta di AA-PBS e creare un'incisione con una lama di rasoio sterile o un bisturi vicino all'equatore dell'occhio (diviso 60/40 con 40 sul lato anteriore). Utilizzando le forbici chirurgiche curve, emisectare l'occhio per isolare l'occhio anteriore (metà corneale).
nota: Il taglio attorno al segmento anteriore deve essere continuo per evitare bordi frastagliati e ruvidi nella sclera che creeranno perdite di liquido dopo l'impostazione nella coltura dell'organo.
- Usa le microforbici come una pala per raccogliere l'umor vitreo dal segmento anteriore. Rimuovere la lente dal segmento anteriore utilizzando le microforbici. Lasciare i segmenti anteriori in AA-PBS fino a ulteriori passaggi di dissezione.
nota: Tutti gli occhi che verranno sezionati possono essere trattenuti in questa fase e uno per uno portati attraverso il resto del processo di dissezione.
- Con un microscopio da dissezione, tagliare gradualmente l'iride alla radice dell'iride, radialmente fino a quando non è visibile la rete trabecolare (TM). La TM è un tessuto pigmentato che comprende fibre orientate circonferenzialmente attorno al guscio corneosclerale. Tagli accurati nell'iride verso la radice dell'iride esporranno la profondità della TM sotto il tessuto.
- Tagliare a 360° intorno all'iride alla stessa profondità del taglio iniziale nel tessuto per esporre l'intera regione TM. Se necessario, pulire eventuali residui di copertura dell'iride TM.
- Tagliare i resti del corpo ciliare posteriormente alla TM, lasciando solo una sottile striscia di tessuto posteriore alla regione TM (circa 1 mm).
- Posizionare il segmento anteriore sezionato (AS) nel terreno fino a quando non viene ulteriormente impostato nella coltura d'organo del segmento anteriore (ASOC) nell'armadio BSC II (cabinet #2).
nota: A questo punto è possibile tenere tutti gli occhi a disposizione prima della configurazione ASOC se un singolo utente sta eseguendo la dissezione e l'assemblaggio della piastra per coltura d'organo.