Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Impostazione dei segmenti anteriori nelle piastre per coltura d'organo
- Posizionare un singolo segmento anteriore (AS) in una piastra di Petri con AS capovolto (coppa verso l'alto). Usando un batuffolo di cotone, bagnare il mezzo e tamponare delicatamente al centro della cornea per rimuovere il pigmento. Usando una pinza per tenere l'occhio e lo stesso tampone, strofina il batuffolo di cotone attorno alla sclera per rimuovere il pigmento in eccesso.
- Capovolgere l'AS e posizionarlo sopra la parte inferiore del piatto sopra la regione rialzata, centrando la cornea sulla regione rialzata nel piatto. Posizionare l'anello di serraggio sopra l'AS appena posizionato.
- Posizionare quattro viti nei fori corrispondenti per tenere l'anello in posizione con l'AS sotto l'anello. Serrare delicatamente a mano le viti con la chiave a L.
nota: La fase di serraggio avverrà quotidianamente durante l'esperimento, quindi l'obiettivo del serraggio iniziale qui è garantire che il fluido non perda evitando di rompere l'anello di serraggio.
- Con un set di piastre di Petri sterili, posiziona la parte superiore sopra la piastra e capovolgi la configurazione. Fissare il supporto per piatti. Collegare i connettori fluidici con O-ring alle porte filettate sul fondo del piatto.
- A un connettore fluidico, collegare un mozzo dell'ago piegato a 90° da 18 G, un tubo di lunghezza, un mozzo dell'ago da 18 G, un filtro per siringa in nylon, una valvola a tre vie e una siringa da 20 ml riempita di fluido.
- Al secondo connettore fluidico, collegare un mozzo dell'ago piegato a 90° da 18 G, la lunghezza del tubo, un mozzo dell'ago da 18 G, una valvola a tre vie e la parte del cilindro di una siringa sterile da 10 ml (che fungerà da serbatoio per raccogliere liquidi e bolle dall'ASOC).
- Con le valvole a tre vie aperte in modo appropriato alle siringhe, spingere delicatamente il fluido attraverso il sistema utilizzando la porta del connettore fluidico identificata nel passaggio 1.5 per gonfiare l'AS, riempire il fluido nel tubo e infine il serbatoio.
nota: Se il fluido fuoriesce nel piatto ASOC, l'AS non è fissato abbastanza saldamente con l'anello di serraggio.
- Rimuovere le bolle spingendo delicatamente il materiale nella piastra e capovolgendo la piastra per spingere fuori le bolle nel serbatoio.
- Posiziona il piatto e mettilo in piedi. Posizionare la parte inferiore di una capsula di Petri sotto i piedi del supporto, facendo attenzione a non impigliare il tubo.
2. Inizio della coltura d'organo del segmento anteriore
- ASOC è ora pronto per l'incubazione. Posizionare la capsula ASOC nell'incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2). Assicurarsi che l'altezza della capsula ASOC nell'incubatrice sopra i trasduttori di pressione sia nota e presa in considerazione per calcolare con precisione la pressione intraoculare (IOP).
- Dirigere le linee dei tubi verso l'esterno attraverso la parte inferiore della porta dell'incubatore a 37 °C, 5% CO2 in modo che non interferiscano con l'apertura e la chiusura della porta. Collegare la siringa da 20 mL al set di siringa con pompa a 2,5 μl/min.
- Posizionare la tubazione con il serbatoio in corrispondenza dello strumento trasduttore di pressione. Collegare la valvola laterale a 3 vie alla configurazione del trasduttore di pressione mentre si fa scorrere il PBS attraverso la linea per evitare che bolle d'aria entrino nelle linee dei tubi.
nota: Svuotare il PBS dai serbatoi dopo che il sistema è stato impostato per ridurre la probabilità di contaminazione del serbatoio con crescita microbica per tutta la durata della coltura dell'organo.
- Avvia la raccolta dei dati IOP assicurandoti innanzitutto che sia presente una scheda microSD per il salvataggio dei file di dati. Quindi, attivare la configurazione del trasduttore di pressione per iniziare la raccolta dei dati.
3. Manutenzione giornaliera di ASOC
- Dopo che l'ASOC ha avuto 24 ore per equilibrarsi, rimuovere le piastre dall'incubatore a 37 °C, 5% CO2 e posizionarle nell'armadio di biosicurezza (BSC) II.
nota: Nell'acquisizione dei dati di pressione, questi periodi di tempo appaiono come picchi quando gli ASOC vengono rimossi dall'incubatore (variazione di altezza) e regolati nell'armadio.
- Verificare la presenza di perdite sotto ogni piatto sulla piastra di Petri. Se presente, verificare la tenuta dei collegamenti fluidici sotto la piastra e serrare nuovamente se necessario. Verificare la presenza di perdite nella parte superiore del piatto utilizzando una chiave a L sterile per serrare le viti nell'anello di serraggio.
nota: Il tessuto AS sclera si comprimerà e ridurrà lo spessore di 24 ore e l'anello di serraggio dovrà essere stretto.
- Aspirare bene il terreno dalla piastra.
nota: La rete trabecolare filtra il fluido dal mezzo che viene pompato nell'ASOC. Pertanto, i media saranno presenti nel piatto ASOC lungo i bordi.
- Ripetere i passaggi 1.7 e 1.8 per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate.
- Riempire le siringhe sulle pompe a siringa, assicurarsi che le pompe a siringa siano in funzione e confermare l'allineamento delle valvole per la perfusione nell'ASOC. Rimettere la capsula ASOC nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2.
nota: In modo ottimale, questi passaggi dovrebbero essere eseguiti quotidianamente. Tuttavia, l'uso di un volume iniziale di 20 mL di terreno, del volume del pozzetto della piastra ASOC e di una velocità di pompaggio di 2,5 μL/min dovrebbe essere sufficiente per far funzionare il sistema per diversi giorni indisturbato.
