Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Affettatura del tessuto del cuore di maiale
- Preparare il bagno di fazzoletti sul vibratomo, aggiungere ghiaccio al rivestimento di raffreddamento del bagno di fazzoletti, quindi aggiungere la soluzione di Tyrode nel bagno di fazzoletti. Predisporre un barattolo di plastica da 1 litro per raccogliere lo smaltimento del ghiaccio sciolto dalla camicia di raffreddamento del bagno in tessuto. Per 1 L della soluzione di Tyrode da affettare, miscelare 3 g/L di 2,3-butandione monoxime (BDM), 140 mM di NaCl (8,18 g), 6 mM di KCl (0,447 g), 10 mM di D-glucosio (1,86 g), 10 mM di HEPES (2,38 g), 1 mM di MgCl2 (1 mL di soluzione 1 M), 1,8 mM di CaCl2 (1,8 mL di soluzione 1 M), fino a 1 L di ddH2O. Regolare il pH a 7,40 utilizzando NaOH. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtraggio/conservazione sottovuoto da 1.000 mL, 0,22 μm e conservare a 4 °C per una notte.
- Sotto la cappa di biosicurezza, trasferire il cuore di maiale in una vaschetta contenente 1 L di soluzione cardioplegica fredda fresca. Per 1 L di soluzione cardioplegica, miscelare 110 mM di NaCl (6,43 g), 1,2 mM di CaCl2 (1,2 mL di soluzione 1 M), 16 mM di KCl (1,19 g), 16 mM di MgCl2 (3,25 g), 10 mM di NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL di eparina, fino a 1 L di ddH2O. Regolare il pH a 7,40 utilizzando NaOH. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtraggio/conservazione sottovuoto da 1.000 mL, 0,22 μm e conservare a 4 °C per una notte.
nota: Aggiungere 1.000 U/L di eparina nella soluzione per cardioplegia il giorno dell'affettatura.
- Sezionare il cuore per isolare il ventricolo sinistro utilizzando bisturi sterili retrattili. Quindi, tagliare il ventricolo sinistro in blocchi di 1−2 cm3 ciascuno utilizzando lame rettangolari di rasoio. Usatene un pezzo per affettare e conservate i pezzi rimanenti in una provetta da 50 ml nella soluzione fredda di Tyrode su ghiaccio per tagliarli in seguito, se necessario.
nota: Massaggiare il fazzoletto prima di affettare con le mani, soprattutto se questo è il secondo blocco. Il massaggio aiuta a ripristinare la corretta configurazione delle fibre muscolari e previene qualsiasi rigidità all'interno del blocco cardiaco.
- Aggiungere 1-2 gocce di colla per tessuti (Tabella dei materiali) al portacampioni in metallo e incollare un pezzo del blocco di agar al 4% con una superficie di circa 1 cm2.
- Aggiungi 1-2 gocce di colla per tessuti sull'agar.
- Attacca il blocco cardiaco all'agar con il lato dell'epicardio cardiaco rivolto verso il basso sulla colla per tessuti e assicurati che sia il più piatto possibile. Quindi, trasferire il supporto del fazzoletto con il blocco cardiaco nella sua posizione nel bagno di affettatura del vibratomo.
- Collegare il tubo dell'ossigeno al bagno di affettamento e il vassoio di metallo riempito con la soluzione di Tyrode per la raccolta delle fette (bagno di Tyrode ossigenato). Quindi, aggiungere filtri cellulari da 40 μm nel vassoio di metallo per raccogliere le fette dopo il taglio.
- Regolazione della posizione di taglio
- Utilizzando il software operativo del vibratomo e il cruscotto, regolare l'altezza della lama/campione. Seleziona il pulsante dell'altezza e segui le istruzioni sullo schermo per regolare l'altezza. Idealmente, avere la lama vicino alla parte superiore del tessuto ma sotto i muscoli papillari e assicurarsi che ci sia del liquido che copre il tessuto e la lama prima di affettare.
- Regola da dove iniziare ad affettare il fazzoletto selezionando il pulsante di avanzamento. Premere il pulsante di taglio e aumentare la velocità utilizzando la manopola per spostare la lama verso il bordo del tessuto. Quindi, premere nuovamente la fetta per interrompere e premere il pulsante di avanzamento per disattivare il processo.
- Regolare i parametri di taglio: velocità di avanzamento = 0,03 mm/s, frequenza di vibrazione = 80 Hz e ampiezza di vibrazione orizzontale = 2 mm. Quindi, inizia ad affettare selezionando il pulsante della sezione.
- Lasciare che il vibratomo tagli fino a raggiungere la fine del tessuto, ma prima che colpisca l'estremità posteriore del portacampioni. A questo punto, premere nuovamente slice per fermare. Premi il pulsante Invio per tornare alla posizione di partenza.
- Seleziona la ripetizione automatica (facendo clic due volte) che consentirà al microtomo vibrante di ripetere automaticamente il processo di affettatura per un massimo di 99 volte.
- Raccolta delle sezioni
- Attendi che le fette siano a tutta lunghezza e appaiano buone (dopo aver superato gli strati muscolari papillari), quindi inizia a raccogliere le fette.
- Raccogli le fette usando una pipetta di plastica Pasteur riempita con la soluzione fredda di Tyrode per afferrare delicatamente il fazzoletto dalla vasca. Se necessario, utilizzare una pinza e delle forbici a molla per dissociare la fetta dal blocco cardiaco se il tessuto è ancora attaccato.
- Trasferire la fetta in un colino cellulare nel bagno di Tyrode ossigenato (vedere il passaggio 1.7) e utilizzare il liquido nella pipetta di plastica Pasteur per far sì che il tessuto si appiattisca su uno dei filtri cellulari, quindi aggiungere una rondella metallica sulla parte superiore per tenere premuto il tessuto.