Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento di complessi cumulo-ovociti suini
- Per raccogliere il materiale per l'isolamento dei follicoli ovarici, asportare le ovaie suine dalle scrofette prepuberi (circa 6-7 mesi di età, del peso di 70-80 kg) presso un macello locale. Scegli circa 20 ovaie di maiale da 10 animali per l'isolamento dei complessi cumulo-ovociti (COC) in ogni esperimento.
nota: Supponendo che ogni ovaia produca 3-5 follicoli, il numero totale di follicoli varia da 60 a 100.
- Mettere le ovaie in un thermos con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4; 38 °C) contenente una soluzione antimicotica all'1% (AAS). Assicurarsi che il materiale sperimentale sia trasportato in laboratorio entro 1 ora, dove viene risciacquato due volte con PBS sterile contenente antibiotici.
- Dopo aver risciacquato le ovaie, trasferirle nel becher riempito con il mezzo di manipolazione (HM) (Table of Materials) e conservarle in un'incubatrice a 38 °C per il tempo di tutte le manipolazioni.
nota: Per ottenere risultati ottimali durante la manipolazione degli ovociti, eseguire tutte le procedure in terreno DMEM/F12 (mezzo di manipolazione, HM) con l'aggiunta del 2,5% di antibiotico/AAS e del 10% di siero fetale bovino (FBS) e controllare il pH al livello di CO2 nell'ambiente, su un tavolo riscaldante con controllo della temperatura (38 °C) e sotto la cappa a flusso laminare per ridurre al minimo la contaminazione batterica.
- Da grandi follicoli suini (6-8 mm di diametro) si raccoglie il liquido follicolare (FF) mediante aspirazione e centrifugazione a 100 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, filtrare il surnatante utilizzando una siringa sterile collegata a filtri per pori a membrana da 0,2 μm e congelare a -80 ° C.
nota: Utilizzare una siringa da insulina (u-40) per l'aspirazione del liquido follicolare.
- Assicurarsi che per l'isolamento dei COC vengano selezionati solo follicoli sani di medie dimensioni (4-6 mm di diametro).
nota: I COC di grado I, che possiedono un ovocita intatto e rotondo con ooplasma omogeneo e cumulo compatto multistrato (almeno 3-4) sono considerati idonei per ulteriori procedure di IVM 3D.
- Per isolare i COC, trasferire 2-3 ovaie in una piastra di Petri sterile di 10 cm di diametro riempita con HM. Isolare i COC da follicoli di medie dimensioni seguendo una delle procedure seguenti.
- Tagliare delicatamente la superficie dei follicoli ovarici sporgenti con una lama chirurgica sterile 15C. Ciò farà sì che il fluido follicolare insieme ai COC fuoriesca nella capsula di Petri.
- Aspirare il contenuto follicolare utilizzando un ago da 28 G della dimensione di 5/8" collegato a una siringa monouso e trasferirlo nella capsula di Petri.
nota: Scartare i resti di tessuto ovarico. Le fasi successive dell'isolamento vengono eseguite sotto uno stereomicroscopio.
- Preparare 3-5 piastre di Petri per fecondazione in vitro da 60 mm.
- Aggiungere 1 mL di HM ai pozzetti centrali e posizionare 3-4 gocce di HM (50 μL per goccia) nei loro anelli esterni.
- Quindi, utilizzando una micropipetta in policarbonato, spostare i COC non danneggiati su gocce di HM negli anelli esterni per sciacquarli brevemente per 3-4 volte.
- Al termine, trasferiteli singolarmente nel pozzetto centrale. Conserva queste piastre per fecondazione in vitro in un'incubatrice per ulteriori procedure.