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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Incapsulamento in microbioattori super-idrofobici di etilene propilene fluorurato (FEP).
NOTA: Assicurati che tutte le procedure di maturazione in vitro (IVM) siano eseguite su un tavolo controllato termostaticamente e che i complessi cumulo-ovociti (COC) siano mantenuti a 38 °C durante la loro manipolazione.
- Preparare una capsula di Petri da 30 mm contenente 5 g di polvere FEP con granulometria media di 1 μm
NOTA: È importante utilizzare polvere FEP fresca. Il FEP riutilizzato tende ad aggregarsi e a formare grumi.
- Distribuire una singola goccia di terreno di maturazione (MM) (~30 μL in volume) contenente 3-5 COC sul letto della polvere FEP. Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per essere sicuri che queste particelle coprano completamente la superficie della goccia liquida e si formino le biglie liquide (LM).
- Prelevare il LM formato utilizzando una pipetta con puntale da 1.000 μl.
NOTA: Tagliare la punta della pipetta sul bordo per adattarla al diametro del LM (4-5 mm). Il diametro approssimativo di una punta così preparata dovrebbe essere leggermente più grande di quello del LM.
- Preparare diverse piastre di Petri per fecondazione in vitro (FIV) da 60 mm. Aggiungere 3-4 ml di acqua sterile agli anelli esterni per preparare la camera di umidità. Quindi, posiziona un LM nel pozzo centrale.
NOTA: Questa procedura richiede una buona manualità e precisione: se la biglia viene posizionata con noncuranza o cade anche da un'altezza ridotta, verrà distrutta.
- Incubare le biglie per 4 giorni a 38 °C in un incubatore al 5% di CO2.
- Cambiare il mezzo ogni giorno seguendo la procedura: applicare 30 μL di MM su ogni LM, che ne causerà la diffusione perché il contatto diretto con il liquido interrompe l'idrofobicità delle polveri FEP rivestite. Quando il contenuto di marmo si dissolve, trasferire i COC rilasciati dal bioreattore in una goccia di MM fresco nella capsula di Petri.
NOTA: Per trasferire con precisione i COC rilasciati, utilizzare una micropipetta in policarbonato.
- Dopo diversi lavaggi in MM (3-4 volte) per rimuovere le particelle di FEP, trasferirle con 30 μL di MM fresco sul letto di polvere FEP. Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per assicurarsi che le particelle di polvere coprano completamente la superficie della goccia di liquido e formino un nuovo LM.
- Prelevare il LM formato utilizzando una pipetta con puntale da 1.000 μl.
- Aggiungere 3-4 ml di acqua sterile agli anelli esterni per preparare la camera di umidità. Quindi, posizionare un LM nel pozzetto centrale della capsula di Petri IVF.
NOTA: Il rivestimento trasparente della polvere FEP consente di monitorare il contenuto di LM utilizzando un microscopio ottico.