Ablazione selettiva laser-assistita di cellule endoteliali corneali suine: una tecnica per indurre una lesione endoteliale corneale suina focalizzata per studi ex vivo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Holzhey, A. et al., Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito da laser di perdita di cellule endoteliali corneali. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra una procedura laser assistita non invasiva per danneggiare selettivamente le cellule endoteliali corneali nell'occhio suino. Il modello ex vivo sviluppato del danno alle cellule endoteliali può essere utilizzato per studiare le malattie dell'endotelio corneale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della coltura d'organo e del trattamento laser

Procurati occhi di maiale appena enucleati dal macello locale. Conservarli al fresco (4 °C) nel terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio, integrato con L-glutammina, piruvato di sodio, penicillina/streptomicina (1%) e siero suino (10%), d'ora in poi indicato in questo articolo come terreno completo.
Rimuovere i tessuti extracellulari con le forbici e immergere gli occhi in una soluzione oftalmica di iodio povidone al 5% per 5 minuti prima di metterli in soluzione salina tamponata con fosfato sterilizzata (PBS) fino al momento dell'uso.
Screening degli occhi per le principali patologie del segmento anteriore, come cicatrici corneali, edema e altre opacità con un dispositivo di tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale (Tabella dei materiali).
Posizionare gli occhi di fronte a un'unità con lampada a fessura dotata di un laser Nd:YAG (Table of Materials), che ha una lunghezza d'onda di 1.064 nm e un diametro della macchia focale di 10 μm in aria.
nota: Per un posizionamento ottimale viene utilizzato un apparecchio di tenuta stampato in 3D, progettato per tenere fermo l'occhio, senza esercitare troppa pressione su di esso (Figura 1).
Utilizzare un ingrandimento di 12x e deviare l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.
Impostare l'energia dell'impulso (ad es. 1,6 mJ) e il punto di messa a fuoco (ad es. 0,16 mm) per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali.
Posizionare una paracentesi corneale trasparente vicino al limbus e iniettare viscoelastico (Tabella dei materiali) per stabilizzare la camera anteriore.
Asportare la cornea centrale trattata al laser utilizzando una trefina da 8 mm.
Posizionare la cornea asportata in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con il sito endoteliale rivolto verso l'alto e incubare il campione in 3 mL di terreno pieno a 37 °C per un massimo di 3 giorni.
nota: Durante questa fase, è possibile aggiungere potenziali agenti citoprotettivi al terreno.

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Risultati

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Figura 1: Configurazione sperimentale.(A) Gli occhi sono stati fissati in un apparato di tenuta parzialmente stampato in 3D, che ha permesso un allineamento preciso rispetto al raggio laser. (B) Prima del trattamento laser, il tessuto è stato valutato con un dispositivo di tomografia a coerenza ottica del segmento anteriore per verificare la presenza di patologie pri...