Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali e alloggio
- Acquista conigli bianchi della Nuova Zelanda (NZW) del peso di 2-3 kg.
- Ospita i conigli da soli in gabbie con rigoroso controllo della temperatura (65 ± 5 °F) e dell'umidità (45 ± 5%). L'illuminazione dovrebbe avere un ciclo di accensione/spegnimento di 12 ore.
- Fornisci accesso illimitato all'acqua e al cibo per conigli standard. Elimina gli arricchimenti alimentari in quanto possono contenere vitamina A che influisce sugli occhi.
- Acclimatare gli animali per almeno 2 settimane prima delle misure di base o dell'induzione dell'occhio secco.
2. Metodi di anestesia ed eutanasia
NOTA: Tutte le procedure richiedono una sedazione lieve tranne l'iniezione di Con A che richiede una sedazione moderata.
- Per una sedazione lieve, iniettare acepromazina (1 mg/kg) per via sottocutanea sulle spalle utilizzando un ago calibro 26. Punto finale per la sedazione lieve: gli animali mantengono una posizione rilassata della testa con i lobi delle orecchie non più completamente eretti.
nota: Se l'endpoint appropriato non viene raggiunto, può essere somministrata un'ulteriore iniezione di acepromazina. Gli animali dovrebbero rimanere sempre svegli, reattivi al tocco dei baffi e non mostrare mai una respirazione rallentata.
- Per una sedazione moderata, somministrare prima agli animali acepromazina come sopra. Dopo aver raggiunto il punto finale (vedere la nota precedente), somministrare isoflurano utilizzando una maschera antigas con flusso di O2 impostato a 1 L/min e erogazione di isoflurano impostata al 5% (Figura 1).
- Somministrare isoflurano fino a quando il tono del corpo del coniglio non è completamente rilassato e le orecchie sono completamente flosce.
nota: Non dovrebbero verificarsi movimenti muscolari compensatori quando l'animale è girato su un fianco; La respirazione rimane sempre spontanea.
- Il recupero spontaneo avviene entro 2-5 minuti: i segni includono movimenti spontanei della testa e tono muscolare aumentato o normale. Dopo che la procedura sperimentale è stata completata con una sedazione moderata, osservare i conigli per circa 30 minuti o fino a quando il loro comportamento non torna alla normali>nota: L'unguento oftalmico non è necessario durante nessuna delle due forme di sedazione. 1) In una sedazione lieve, gli animali sono ancora vigili e mantengono un riflesso di battito delle palpebre. Nella sedazione moderata, l'inibizione del riflesso dell'ammiccamento è così breve che la superficie oculare non è a rischio. 2) Il posizionamento di unguento oftalmico sulla superficie oculare preclude la visualizzazione delle strutture valutate durante il test.
- Eutanasia: utilizzare un sovradosaggio di pentobarbital per via endovenosa (100 mg/kg).
3. Induzione e trattamento dell'occhio secco
NOTA: Vengono iniettate tre porzioni del sistema della ghiandola lacrimale orbitale.
- Sedare i conigli con acepromazina 0,2 mg/kg per via sottocutanea.
- Tagliare il pelo nella zona periorbitale e del cuoio capelluto e rimuovere completamente eventuali residui di pelo utilizzando Nair. Lasciare la pelle completamente liscia per una migliore visualizzazione dei segni anatomici e l'iniezione ecoguidata di concanavalina A (Figura 2).
- Indurre una sedazione moderata come descritto sopra.
- Iniezione della porzione palpebrale della ghiandola lacrimale superiore (PSLG)
nota: Eseguire prima l'iniezione di PSLG.
- Applicare sull'occhio appropriato 25 μL di lidocaina senza conservanti all'1% con una micropipetta.
- Estroflettare la palpebra superiore e applicare una leggera pressione mediale sul bordo orbitale posteriore fino a quando non si vede la protuberanza che segna la porzione palpebrale della ghiandola. Il PSLG appare come una piccola elevazione bulbosa nella porzione posteriore (temporale) della palpebra superiore.
nota: Per visualizzare il tessuto ghiandolare durante il processo di apprendimento, applicare il 5% di fluoresceina sull'area (Figura 3A). Si possono vedere le lacrime che scorrono dal PSLG bulboso. L'applicazione di fluoresceina non è necessaria per la somministrazione di Con A; Viene fatto solo a scopo illustrativo per mostrare il tessuto ghiandolare.
- Utilizzando una pinza a denti fini e un ago calibro 27 su una siringa di tubercolina, penetrare direttamente nella ghiandola utilizzando un approccio transcongiuntivale. Far avanzare l'ago di 2 mm nel tessuto e iniettare 500 μg di Con A in un volume di 0,1 mL (Figura 3B).
NOTA: Questa iniezione a volte può essere dolorosa. Se necessario, tenere gli animali sotto isoflurano fino al completamento di questa iniezione.
