Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento delle cellule endoteliali dell'aorta suina
- In condizioni asettiche, rimuovere l'aorta di maiale dal tampone di lavaggio e posizionarla su una piastra di Petri da 150 mm (Figura 1A).
- Tagliare delicatamente le due estremità dell'aorta e asportare nuovamente il tessuto in eccesso attorno all'aorta con pinze e forbici sterili (Figura 1B). Lavare l'esterno e l'interno dell'aorta (sopra la piastra di coltura a temperatura ambiente) con 20-50 ml di tampone di lavaggio: 1x soluzione PBS (pH 7,4) con penicillina/streptomicina all'1% (v/v).
nota: Cerca di tagliare solo l'area in cui sono stati posizionati i morsetti durante l'intervento chirurgico poiché alcune EC sono state danneggiate in quest'area e rimuovi i tessuti in eccesso e i rami laterali arteriosi.
- Far passare una sutura chirurgica attraverso l'aorta e poi legare un'estremità dell'aorta usando la sutura chirurgica (5-0, 90 cm, Tabella dei materiali). Mantenere la sutura chirurgica all'interno dell'aorta (Figura 1C, D).
- Fissare delicatamente l'aorta vicino all'estremità legata con una pinza, quindi tirare lentamente la sutura chirurgica per invertire l'aorta fino a quando la superficie endoteliale dell'aorta non è esposta (Figura 1E-G).
nota: Assicurarsi di fissare l'aorta vicino all'estremità legata e non fissare saldamente l'aorta, altrimenti l'aorta non può essere invertita tirando la sutura chirurgica.
- Lavare la superficie endoteliale dell'aorta con un tampone di lavaggio 3 volte (10 ml per lavaggio), quindi scartare questa soluzione. Posizionare l'aorta in una provetta da centrifuga da 15 mL e coprire l'aorta con 10 mL di soluzione digestiva di collagenasi IV allo 0,005% nella provetta (Figura 1H).
nota: Preriscaldare la soluzione digestiva di collagenasi EV allo 0,005% a 37 °C prima della digestione.
- Incubare a 37 °C per 15 minuti. Mettere l'aorta digerita e la soluzione digestiva in un piatto di coltura da 100 mm e arrestare gli effetti della collagenasi EV allo 0,005% aggiungendo 10-15 mL di tampone di arresto pre-raffreddato: il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di FBS inattivato a caldo e l'1% di P/S.
nota: Il tempo di digestione consigliato è compreso tra 10 e 20 minuti. Assicurarsi che la superficie endoteliale dell'aorta sia coperta dal tampone di arresto.
- Raschiare delicatamente i pAEC dalla superficie interna dell'aorta utilizzando un raschietto cellulare (Figura 1I). Lavare l'aorta raschiata 3 volte con un tampone di lavaggio (5 ml alla volta). Mettere la soluzione della piastra di coltura in una provetta da centrifuga da 50 mL. Lavare il fondo della piastra di coltura 2 volte con un tampone di lavaggio (5 mL alla volta) e mettere nuovamente la soluzione in una provetta da centrifuga da 50 mL.
nota: Raschiare delicatamente in una direzione e non comprimere. Non toccare il fazzoletto vicino ai bordi e ai fori. Si consiglia di raschiare 5-8 volte.
- Centrifugare la provetta a 600 x g per 6 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante e lasciare 10 mL di soluzione sul fondo di una provetta da centrifuga da 50 mL. Aggiungere 20 mL di tampone di lavaggio alla provetta da centrifuga da 50 mL e risospendere i pellet. Evita le bolle durante questo passaggio.
- Centrifugare a 600 x g per 6 minuti a 4 °C. Scartare lentamente il surnatante. Risospendere i pellet cellulari con 1 mL di terreno di coltura e mescolare bene.
nota: Il numero medio ottenuto di EC per cm di aorta è 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (media ± SD, n = 3).
- Contare le celle con un contatore di celle. Piastra e coltura delle cellule in un recipiente senza rivestire alcun materiale in base al numero di cellule. Se il numero di cellule è inferiore o uguale a 1,0 x 10⁶, coltivare le cellule in un pallone da 25 cm². Se il numero di cellule è maggiore di 1,0 x 10⁶, coltivare le cellule in diversi flaconi da 25 cm² (1,0 x 10⁶ cellule per pallone). Mettere il pallone in un'incubatrice (senza agitare) a 37 °C con il 5% di CO₂ e sostituire il fluido ogni 2-3 giorni.
nota: Alcune cellule vengono danneggiate dal raschietto cellulare. Un test di vitalità cellulare ha rilevato che la percentuale di cellule vive era del 95,7% ± dell'1,7% (media ± DS, n = 3). Il tempo di raddoppio delle cellule isolate è di circa 1-2 giorni.
