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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento delle arterie ciliari posteriori corte
Gli occhi suini insieme al nervo ottico e ai tessuti extraoculari sono stati ottenuti immediatamente post-mortem. Gli occhi enucleati sono stati trasportati in laboratorio in soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) e utilizzati immediatamente.
NOTA: L'occhio suino è fondamentalmente diviso in sezioni anteriori (Figura 1A) e posteriori (Figura 1B).
- Posizionare il globo oculare in una camera di dissezione contenente un tampone Krebs-Henseleit (K-H) ghiacciato. Taglia via con cura i muscoli e i tessuti circostanti con un paio di forbici Mayo affilate.
nota: Per preparare il tampone Krebs-Henseleit (K-H), pesare le seguenti sostanze chimiche (27,68 g di NaCl, 8,4 g di NaHCO, 3,1,4 g di KCl, 1,18 g di MgSO4 e 0,64 g di KH2PO4) in una provetta da centrifuga conica da 50 mL asciutta e pulita e 1,47 g di CaCl2 e 8,0 g di glucosio in un'altra provetta. La miscela in polvere di queste sostanze chimiche deve essere conservata in un luogo fresco e asciutto. La miscela di CaCl2 e glucosio in polvere è meglio preparata fresca per prevenire l'assorbimento di umidità e la formazione di grumi.
- Fai un'incisione con un bisturi e taglia il globo lungo il piano equatoriale con un paio di forbici Mayo affilate fino a quando l'occhio non si separa nelle metà anteriore e posteriore. Rimuovere quanto più corpo vitreo possibile dalla metà posteriore dell'occhio utilizzando un paio di pinze standard.
nota: La separazione del globo oculare in due metà facilita l'isolamento delle arterie ciliari posteriori corte (sPCA) con facilità senza avere un occhio in movimento nel piatto di dissezione. Tuttavia, questo passaggio non è obbligatorio. I vasi possono anche essere isolati senza aprire il globo oculare.
- Utilizzare perni di dissezione per fissare con cura la metà posteriore dell'occhio con la retina rivolta verso il basso e il nervo ottico rivolto verso l'alto verso lo sperimentatore.
- Taglia delicatamente i tessuti connettivi che circondano il nervo ottico per esporre la vascolarizzazione retrobulbare sottostante con un paio di forbici a molla Student Vannas.
- La sPCA può essere vista come brevi rami di vasi (tra 5-8 rami) che penetrano nella sclera e circondano circonferenzialmente la testa del nervo ottico (Figura 1C). Isolare lo sPCA paraottico e distale insieme ai tessuti connettivi circostanti con un paio di pinzette di precisione di tipo 5 e forbici per capsulotomia Vannas (Figura 1D).
nota: Assicurarsi che il tampone K-H rimanga ghiacciato durante tutta la procedura di isolamento. Si consiglia vivamente di sostituire il tampone ogni 20-30 minuti, a seconda della temperatura ambiente.
2. Preparazione del campione
- Rimuovere delicatamente i tessuti connettivi dai segmenti arteriosi utilizzando una pinzetta di precisione di tipo 5 a punta extra fine e le forbici per capsulotomia Vannas sotto uno stereomicroscopio e sciacquare le arterie isolate in PBS ghiacciato per rimuovere contaminanti e residui di sangue><.
nota: Se i campioni non vengono sottoposti immediatamente alle fasi successive, congelarli in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
